Valomikroskopian alkeet

1. Valomikroskopian alkeet Mikael Niku ELTDK / PELL / Anatomia, 2001 Histologisten tekniikoiden alkeet

2. Mikroskopiaa jo 1600-luvulta Kuvat: Molecular Expression Microscopy Primer (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/) Histologisten tekniikoiden alkeet

3. Valomikroskoopin osat Kurssilla käytettävä Olympus CH2-mikroskooppi Histologisten tekniikoiden alkeet

4. Valonlähde • Yleensä volframihalogeenilamppu • Kirkkaus säädettävissä jännitettä muuttamalla • Huomaa, että valon väri muuttuu samalla! Tämä on muistettava varsinkin valokuvattaessa. • Lamppuun ei saa koskea paljain sormin! Histologisten tekniikoiden alkeet

5. Kenttähimmennin • Säätelee kondensoriin pääsevän valopylvään leveyttä • Vähentää heijastuksia ja sirontaa • CH2:ssa säädettävä himmennin lisä-varusteena (kiinnitys nuolen osoittamaan kohtaan) Histologisten tekniikoiden alkeet

6. Kondensori • Keskittää valon tasaisesti näytteeseen • Säädöt vaikuttavat ratkaisevasti kuvan laatuun: korkeus ja apertuurihimmentimen asento Histologisten tekniikoiden alkeet

7. Kondensorin apertuurihimmentimen vaikutus Histologisten tekniikoiden alkeet

8. Ristisiirtopöytä • Tähän pannaan näyte • Liikuttelu tarkasti X- ja Y-suunnassa • Asteikkojen avulla voidaan merkitä muistiin kiinnostavan kohteen sijainti Histologisten tekniikoiden alkeet

9. Objektiivit • Valomikroskoopin tärkein (ja kallein!) osa • Mitä enemmän erilaisten taittovirheiden korjausta, sitä parempi kuva (ja kalliimpi hinta) • Akromaattiset halvimpia ja tavallisimpia, apokromaattiset kalleimpia; tasokorjatuissa (plan) kuva kaartuu vähemmän • Kiinnitys revolveriin kierteellä Histologisten tekniikoiden alkeet

10. Objektiivien merkinnät Histologisten tekniikoiden alkeet

11. Objektiivien merkinnät: numeerinen apertuuri • Numeerinen apertuuri (N.A.): mitä suurempi, sitä kirkkaamman kuvan objektiivi tuottaa ja sitä pienemmät yksityiskohdat erottuvat – toisaalta syvyysterävyys pienenee • Ilman immersioaineita käytettävissä objektiiveissa N.A. korkeintaan 0,95; öljyimmersiolla jopa 1,4. Siksi yli 40X suurentavat objektiivit yleensä öljy-immersio-objektiiveja. Histologisten tekniikoiden alkeet

12. Objektiivien merkinnät: tubuspituus • Kertoo, millaista mikroskoopin tubuspituutta (mitta objektiivin kiinnityskohdasta okulaarin kiinnityskohtaan) varten objektiivi on optimoitu • Vanhemmissa objektiiveissa yleensä 160 tai 170 mm, uudemmissa ääretön Histologisten tekniikoiden alkeet

13. Öljyimmersio • Öljyn taitekerroin vastaa peitinlasin taitekerrointa, joten valo ei taitu rajapinnassa  objektiivin numeerinen apertuuri saadaan suuremmaksi • Voidaan käyttää vain erityisillä immersio-objektiiveilla! Histologisten tekniikoiden alkeet

14. Okulaarit • Suurentavat objektiivin kuvaa vielä lisää • Okulaarin suurennoksen ei kannata kuitenkaan olla rajattoman suuri: kokonais-suurennos (objektiivin suurennos x okulaarin suurennos) 500-1000 x objektiivin N.A.; yleensä 4-25X • Mieluummin 40X objektiivi ja 10X okulaari kuin toisin päin, jotta saadaan suurempi N.A. käyttöön • Kiinnitetään tubuksen helakkeeseen yksinkertaisesti työntämällä Histologisten tekniikoiden alkeet

15. Mikroskoopin käsittely • Ole varovainen, äläkä hosu! • Mikroskopoi tukevalla alustalla poissa kirkkaasta valosta ja pölystä. • Pidä lasipinnat puhtaina – ole erityisen huolellinen immersioöljyn kanssa! • Kun lopetat käytön, peitä mikroskooppi hupulla. Varo, ettei kuuma lamppu-kammio sulata huppua! • Älä auo mikroskooppia itse äläkä irrottele objektiiveja… ne nimittäin tipahtavat helposti! Histologisten tekniikoiden alkeet

16. Mikroskoopin käyttö • Sytytä valo. • Aloita pienimmällä objektiivilla: näyte löytyy helpommin, ja vältyt kolauttamasta objektiivia näytteeseen! • Aseta näyte ristisiirtopöydälle. • Tarkenna pienellä objektiivilla ja karkeasäädöllä. Säädä ensin sivusta katsoen lähelle näytettä. Katso sitten okulaariin ja tarkenna poispäin näytteestä. • Säädä silmäväli ja diopterisäätö. • Valitse sopiva objektiivi. • Säädä valon voimakkuus sopivaksi. • Tarkenna hienosäädöllä. • Säädä apertuurihimmennin. Histologisten tekniikoiden alkeet

17. Katsele oikein! • Käytä molempia silmiä! • Säädä okulaarit ja tubus itsellesi sopiviksi. • Tarkenna niin, että silmät saavat olla leppoisasti lepotilassa. • Tottumattomalle saattaa alkuun tulla ankarasta mikroskopoinnista huono olo, vaikka säädöt olisivatkin kunnossa… Histologisten tekniikoiden alkeet

18. Tarkennus • Yleensä nostamalla ja laskemalla ristisiirto-pöytää • Aloita pienellä objek-tiivilla, jotta et kolauta etulinssiä preparaattiin! • Ole varovainen erityisesti paljon suurentavien objektiivien kanssa. • Huomaa CH2:ssa karkeasäädön rajoitinvipu! Histologisten tekniikoiden alkeet

19. Okulaarien ja tubuksen säädöt • Tubuksen silmävälin säätö: • Tarkenna preparaattiin 10X objektiivilla. • Säädä silmäväli niin, että molempien silmien näkökentät yhtyvät. • Näkövirheen korjaus: • Peitä vasen okulaari vaikkapa paperilla. • Tarkenna kuva oikealle silmälle. • Peitä vuorostaan oikea okulaari. • Tarkenna kuva okulaarihelaketta säätämällä. Histologisten tekniikoiden alkeet

20. Köhleröinti • Valaisujärjestelmän ihanteellinen säätö, joka tuottaa parhaan mahdollisen kuvan • Valonlähteen kuva fokusoidaan kondensorin apertuurihimmentimeen  valonsäteet kohdistuvat näytteeseen rinnakkain ja tarkentumatta siihen  tasainen valaisu • Säädettävä aina objektiivia vaihdettaessa, tärkeää varsinkin valokuvauksessa! Histologisten tekniikoiden alkeet

21. Köhleröinnin suoritus - 1 • Aseta näyte mikroskooppiin ja tarkenna. • Sulje kenttä-himmennintä, kunnes sen reunat näkyvät kuvassa (yleensä tässä vaiheessa sumeina – ks. kuva!) Histologisten tekniikoiden alkeet

22. Köhleröinnin suoritus - 2 • Tarkenna kenttähimmentimen kuva kondensoria nostamalla tai laskemalla. • Siirrä kuva keskelle näkökenttää vääntämällä kondensorin keskitys-ruuveja (kuva!). Histologisten tekniikoiden alkeet

23. Köhleröinnin suoritus - 3 • Avaa kenttähimmennintä, kunnes n. ¾ näkökentästä näkyy. Tarkenna uudestaan. Histologisten tekniikoiden alkeet

24. Köhleröinnin suoritus - 4 • Avaa kenttähimmennintä sen verran, että koko kuva-ala valaistuu juuri ja juuri. Älä avaa yhtään enempää – se vain aiheuttaa heijastuksia ja huonontaa kontrastia. Histologisten tekniikoiden alkeet

25. Köhleröinnin suoritus - 5 • Säädä apertuurihimmennin: • Jos kondensorissa on asteikko, säädä arvoksi 70-80% objektiivin N.A.:sta. • Jos ei ole, poista toinen okulaari helakkeesta ja kurkista sisään. Sulje himmennintä, kunnes näet valoisana 70-80% näkökentästä. Histologisten tekniikoiden alkeet

26. Öljyimmersion käyttö • Etsi näytteestä haluttu kohta ja tarkenna 10X tai 40X objektiivilla. • Käännä immersio-objektiivi siten, että saat tipan öljyä sen etulinssiin. • Laita tippa myös preparaatin päälle. • Käännä objektiivi kohdalleen. Öljyn pitäisi täyttää etulinssin ja peitinlasin väli. Varo, ettei linssi kolahda näytteeseen! • Tarkenna hienosäädöllä. • Jos öljyyn jää ilmakuplia, kääntele objektiivirevolveria varovasti. Öljyn kanssa on oltava tarkkana! Älä sotke muita objektiiveja siihen. Poista öljy huolellisesti käytön jälkeen – sitä ei ikinä saa jättää kuivumaan mikroskooppiin! Histologisten tekniikoiden alkeet

27. Mikroskoopin hoito • Pidä kaikki lasipinnat puhtaina. • Puhdistus: • Puhalla puhaltimella irtoroskat pois • Pyyhi optiikka puhdistusnesteeseen kostutetulla vanupuikolla pyöritellen • Kuivaa heti vanupuikolla tai linssipaperilla • Missä lika on? • Kökön sijainti selviää yleensä liikuttelemalla okulaaria, objektiiveja, kondensoria… Histologisten tekniikoiden alkeet

28. Lisää tietoa • Valtavan hieno pläjäys mikroskopiasta verkossa (mm. havainnollisia Java-interaktioita):http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ Histologisten tekniikoiden alkeet