Импульсная Фурье ЯМР спектроскопия

1. Импульсная Фурье ЯМР спектроскопия Постоянное возбуждение с меняющейся частотой Импульсное возбуждение с последующим Фурье преобразованием 1. Короткому импульсу монохроматического излучения с частотой ν0 и длиной τ в частотной области соответствует определенная полоса частот Δν , центрированная на частоте ν0 2.С уменьшением длины импульса ширина полосы частот увеличивается и наоборот. Так, например, длине импульса 10 микросекунд соответствует полоса частот 16KHz. 3. Стандартная ширина протонных химических сдвигов у белков 15 ppm. В магнитном поле с напряженностью 7.05 Т (ν0 =300 МHz для 1H) интервал 15 ppm соответствует полосе частот 4.5 KHzдля1H. В магнитном поле 14.1 Т эта полоса составит 9 KHz. Время Частота

2. Математическое Фурье преобразование Временной спектр ЯМР этанола Частотный спектр ЯМР этанола → ← Время Частота

3. Экспериментальные схемы с применением одиночного импульса 1)Система спинов в равновесии 2) Короткий прямоугольный импульс. 3) Отклик системы спинов на импульс и его регистрация 4) Временная задержка, необходимая, чтобы система пришла в равновесие (обычно 2-3 Т1) 5) Многократное накопление Импульс Отклик системы на импульс Время релаксации Мертвое время Последовательность событий: Длина импульса определяет угол поворота вектора магнетизации Угол поворота вектора магнетизации α, (в радианах) равен α = γ B1tp Длина типичного 90о импульса около 10-5 c. Для 180о импульса эта величина в 2 раза больше.

4. SI Эффект Оверхаузера Схематическое представление эффекта Оверхаузера  Молекула содержит два спина I и S, которые не перекрываются, так что каждый из них может быть представлен как синглет (а). После насыщения спина S величина сигнала спина I может увеличится (b), уменьшится (c), стать отрицательной (d) NOE = (I –I0)/I0  NOE ~ f(rIS) f(τc)  fI(S) = 1/(2 + Ar6IS) • Уравнения, описывающие эффект Оверхаузера, показывают, что • Эффект проявляется в изменении интенсивности линий в спектре ЯМР • Величина эффекта зависит от двух вкладов, один из которых связан с расстоянием между спинами, а второй от вращательного корреляционного времени молекулыτc. Это времяобратно пропорционально коэффициенту вращательной диффузии молекулы Dr • Эффект проявляется только для близких соседних спинов, расстояние между которыми меньше 5-6 Å.

5. Двумерная ЯМР спектроскопия Двумерная корреляционная ЯМР спектроскопия – метод, который коррелирует (сравнивает между собой) два сигнала, объединенные некоторым общим взаимодействием. Четыре временных периода 1) приготовление 2) развитие (время t1) 3) смешение 4) детектирование (времяt2) Двумерный ЯМР на практике означает, что измеряемый на выходе сигнал является функцией двух времен, а после Фурье-преобразования – двух частот Общая схема двумерного ЯМР очень гибкая и на сегодня известны сотни разных последовательностей, предназначенных для решения тех или иных конкретных задач. Например, HMQS-HOHAHA есть система импульсов состоящая из Heteronuclear multiple-quantum correlation experiment +Homonuclear Hartman-Hahn spectroscopy Важными и относительно простыми схемами в ЯМР являются: 1) Корреляционная спектроскопия (COSY), которая идентифицирует пары протонов, связанные скалярным спин-спиновым расщеплением 2) Корреляционная спектроскопия (NOESY), которая идентифицирует близость пар протонов, связанные эффектом Оверхаузера

6. Корреляционная ЯМР спектроскопия (COSY) Контурная карта (смотри следующий слайд) 1H-1H COSY спектра двух связанных спинов. Картина всегда симметрична относительно диагонали. Черные кружки представляют диагональные пики; открытые кружки кросс-пики. Появление последних означает, что два спина сближены. Заметим, однако, что расстояния между ними в COSY не определяется. Последовательность импульсов в COSY Сокращенная запись выглядит так: 90o – kt1 – 90o – t2,где k = 0, 1, 2…2n. Эксперименты повторяются с шагом к равным 1. Одномерный спектр ЯМР для двух 1H-1H спинов

7. 1D и 2D ЯМР спектры небольшого белка, протеазного ингибитораK (57 аминокислот) в 0.01 M, pD 3.4, 25oC, 360 MHz. Контурное представление COSYспектра. Третья координата - интенсивность. 1D 1H спектр Этажерочное представление COSY спектра Контурное представление COSY спектра наглядно показывает способность к взаимодействию различных групп протонных пиков. Укажем лишь на один пример. Так, имеется взаимодействие высокопольных метилов (ω1 = -0.9 ppm, ω2 = -0.9 ppm). Картинка всегда симметрична относительно диагонали.

8. Nuclear Overhauser Enhanced Spectroscopy (NOESY). Вверху: последовательность импульсов в NOESY. Сокращенная запись выглядит так: 90o – t1 – τm- 90o –t2 Внизу: схематическая контурная карта спектра, состоящего изпятирезонансных линий (А, B, C, D и E). Появление трех кросс-пиков свидетельствует, что резонансы, соответствующие этим пикам сближены в пространстве (А и C, B и D, B и Е). Контурная карта протонного двумермого NOE спектра бычьего трипсинового панкреатического ингибитора (360 MHz, концентрация белка 0.02 М, pH 3.8) На карте выявляется множество кросс-резонансных пиков, отражающих сближенность в пространстве некоторых аминокислот. Аминокислоты обозначены (A=alanine, T=threonine, C=cysteine, Q=glutamine, F=phenylalanine). Aмидный протон Glu 31 (на карте Q31NH) контактирует с α-протоном Cys 30 (на карте C30 α-H), aмидный протон Phe 33 (на карте F33NH) контактирует с α-протоном Тhr 32 (на карте Т32 α-H)

9. Многомерный, гомо- и гетероядерныый ЯМР 2D-ЯМР: два времени 3D-ЯМР: три времени 4D-ЯМР: четыре времени Соотношения между последовательностями импульсов для записи 2D, 3D, 4D ЯМР. Сокращения: P- подготовка; Е-эволюция; M-смешение; D-детектирование 2D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Da(t2) 3D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Eb(t2)→Mb→Db(t3) 4D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Eb(t2)→Mb→Ec(t3)→Mc→Dc(t4) A B • 3D гетероядерный ЯМР окисленногоглютеродоксина из Е.Coli.Белок обогащен 15N •  (B) Двумерный спектр (b), как функция еще одной частоты(а). • Многомерный спектр – • Большая Советская • Энциклопедия • (от одной строчки • до 60 томов)