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蛋白质芯片研究进展

Seminar I. 蛋白质芯片研究进展. 高 雁 指导老师：林炳承 研究员. 内容提要. 蛋白质芯片概述 蛋白质芯片的关键技术 蛋白质芯片的应用 展望. 基因芯片. 生 物 芯 片. 蛋白质芯片. 微流控芯片. 蛋白质芯片的定义. 蛋白质芯片 , 又称 蛋白质阵列 或 蛋白质微阵列 ，是指以蛋白质分子作为配基 , 将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。.

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蛋白质芯片研究进展

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Presentation Transcript

  1. Seminar I 蛋白质芯片研究进展 高 雁 指导老师：林炳承 研究员

  2. 内容提要 • 蛋白质芯片概述 • 蛋白质芯片的关键技术 • 蛋白质芯片的应用 • 展望

  3. 基因芯片 生 物 芯 片 蛋白质芯片 微流控芯片 蛋白质芯片的定义 蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411. www.proteinmicroarrays.com/

  4. 研究蛋白质芯片的意义 • 蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物质层面； • 探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测； • 适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物； • 有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。

  5. 蛋白质芯片的分类 • 蛋白质检测芯片 • 蛋白质功能芯片 Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161–170.

  6. 蛋白质芯片的关键技术 1 2 蛋白质芯片制备 提出生物学问题 （实验目的） 数据分析和建模 （图象量化，标准化， 采集蛋白信息，建立模型） 样品预处理 （重组蛋白，制备一、二级抗体， 荧光标记，配蛋白印记缓冲液） 3 6 检测 （荧光和比色扫描或拍照， 参数设置） 生化反应 化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件 4 5 Schena M, Protein microarrays,2005, 7.

  7. 蛋白质芯片的制备 固定微阵列上的蛋白样点 膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白 微阵列的封闭主要封闭试剂：BSA或Gly • 固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片） • 蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解 • 点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等 李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33.

  8. 蛋白质芯片比较 表面 蛋白固定方式 优点 缺点 PVDF 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，分布随机 Nitrocellulose 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，高背景，低密度 无需蛋白修饰过程，高密度， 非特异吸附，分布随机 高分辨检测 Epoxy-activated 高密度，高分辨检测 分布随机，表面有吸附 PDMS nanowell高密度，适合复杂的生化分析 Gold coated silicon 高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化 Avidin coated亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化 Ni-NTA coated亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记 表面蛋白分布均一容量 Agarose thin film制作难，未商品化 3D gel pad 吸附，共 价偶联 Poly-lysine coated Aldehyde-coated 共价 偶联 扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量 Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology,2003,7,55-63.

  9. 蛋白质芯片检测 • 无探针标记检测法 • 探针标记检测法 • 表面增强激光解吸离子化技术 • (Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI) • 表面等离子体共振检测技术（surface plasmon resonance, SPR） • 原子力显微镜检测技术 • （atomic force microscope, AFM ） • 同位素标记检测 • 荧光标记检测 • 化学发光检测 • 酶免疫标记检测 • 胶体金标记检测

  10. 蛋白质芯片的应用 • 疾病诊断和预警 • 药物开发 • 蛋白质组学

  11. 疾病诊断 定量检测组织提取液中的肿瘤标记物 孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原 uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGT 血管内皮生长因子 微阵列方法与ELISA方法检出结果比较 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436.

  12. 药物开发 高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂 His6-RB/GST-E7相互作用抑制剂筛选微阵列图 加入His6-RB 加入含 PepC抑制剂的His6-RB A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.

  13. 蛋白质组学 人动脉平滑肌细胞蛋白谱 4.7%抗原（一组细胞-细胞间相互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降 检出298个蛋白 54个蛋白表达量发生变化 细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱 揭示了oxidized low density lipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式 Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280.

  14. 存在的问题 • 成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器 • 芯片的标准化问题 • 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等

  15. 展望—蛋白质芯片未来的发展重点 • 建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。 • 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。 • 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 • 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。

  16. 参考文献 [1] Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. [2] Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411. [3] Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161–170. [4] 李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33 [5] Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology, 2003,755-63. [6] Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436. [7] Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991. [8] Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280. [9] Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431. [10] Schena M, Protein microarrays,2005, 7.

  17. 谢谢！

  18. 蛋白质芯片检测信号的提高 优化芯片制作过程各种参数； 使用金粒子作为辅助标记分子； 添加SiO2和TiO2层提高表面反射 Au-labelled anti-rabbit IgG放大照片 • Au 的尺寸及其与Dy633的比例 对信号的影响 • 5 nm Au-particle • 10 nm Au-particle. Sauera U，et al., Sensors and Actuators B, 2005, 107, 178–183.

  19. Protein Microarray System • The Protein Microarray System is a complete microarray platform that includes microarray manufacturing, processing, surface chemistry, detection and analysis. It is suitable for a variety of proteomic applications including Micro Multianalyte Immunoassays, protein-antibody, antibody-protein, antibody-antigen, protein-protein, and protein-drug microarray assays. TeleChem / arrayit.comhttp://arrayit.com

  20. 药物开发 G-蛋白偶联受体芯片 肾上腺素受体芯片（含三个亚型）筛选抑制剂 抑制剂 Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991.

  21. SELDI把基质改为 www.evms.edu/vpc/ seldi/seldiprocess/

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