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第六章 药品的冷冻干燥. 药品冷冻干燥的基本问题 纤维蛋白原的冷冻干燥 脂质体的冷冻干燥. 6.1 药品冷冻干燥的基本问题 1. 药物的新剂型. 任何一种药物在临床使用前都必须制成适合于患者的安全、有效、稳定的给药形式，即剂型（ Dosage form ）。 从药物剂型发展来看 , 剂型大致可以分为以下几代： 第一代是简单加工供口服和外用的 膏丹丸散 ； 第二代是机械化、自动化生产的 片剂、注射剂、胶囊剂与气雾剂 等； 第三代是 缓释、控释的剂型 ，以形成缓释、控释的给药系统（ Drug delivery system, DDS ）；
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第六章 药品的冷冻干燥 药品冷冻干燥的基本问题 纤维蛋白原的冷冻干燥 脂质体的冷冻干燥
6.1药品冷冻干燥的基本问题1.药物的新剂型 任何一种药物在临床使用前都必须制成适合于患者的安全、有效、稳定的给药形式，即剂型（Dosage form）。 从药物剂型发展来看,剂型大致可以分为以下几代： • 第一代是简单加工供口服和外用的膏丹丸散； • 第二代是机械化、自动化生产的片剂、注射剂、胶囊剂与气雾剂等； • 第三代是缓释、控释的剂型，以形成缓释、控释的给药系统（Drug delivery system, DDS）； • 第四代是靶向剂型，以形成靶向给药系统； • 第五代是能在发病高峰期间在体内自动释药的剂型。 • 冷冻干燥技术在上述的第二代至第五代的药物剂型制备中被广泛地应用；特别是在包合技术、脂质体制备技术、微囊化技术起着重要的作用。
2.生物药品 （1）定义和分类 • 药品大致上可以分为3类：化学药物（也称合成药物）；生物药物（生化药物）；和中药（天然药物）。 • 生物药品是以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量，所制成的生物活化制剂。
按照所采用的生物学工艺，可以大致将生物药品分成四类：按照所采用的生物学工艺，可以大致将生物药品分成四类： • 采用发酵工程制成的药品。这些是指利用微生物代谢过程生产的药品，如抗生素、维生素、有机酸、辅酶、酶抑制剂、激素、免疫调节物质，以及其他生理活性物质。 • 采用基因工程制成的药品。这些是指利用重组DNA 生产的蛋白质和多肽类药品，如干扰素、胰岛素、白细胞介素-2 等。 • 采用细胞工程制成的药品。这些是指利用动、植物的细胞培养生产的药品，如人类生理活性因子、疫苗、单克隆抗体等。 • 采用酶工程制成的药品。这些是包括药用酶，和将酶或细胞固定化后生产的药品。如蛋白酶、尿急酶、L-天冬酰胺酶、维生素C等。
生物药品正处于快速发展阶段，据2002年统计，已经临床使用的133种生物药物。生物药品正处于快速发展阶段，据2002年统计，已经临床使用的133种生物药物。 • 按照药物的临床用途,生物药品包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、血清、血液制品、免役制剂、细胞因子、抗原、单克隆抗体及基因工程产品（DNA重组产品、体外诊断试剂）等。 • 目前主要生物药品产品有： 人血白蛋白、促红细胞生成素（EPO）、白介素、干扰素类、单克隆抗体、疫苗类、集落刺激因子、人生长激素、胰岛素、细胞因子、受体类药物、凝血Ⅷ因子等；疫苗以乙肝病毒疫苗为主，此外还有用于检测诊断的PCR技术的试剂、克隆用的探针等实验用品。正在开发生物药物有：肿瘤疫苗、多肽药物、生物技术体外诊断试剂等。
（2）生物药品的特点 • 成分复杂，而且很难精确确定； • 由于大多是由多种蛋白质等组成，而且具有活性，因此受温度等的影响很大，不稳定，易变性和失活；生产过程参数变化对产品的质量影响很大； • 易被微生物等污染和破坏。 对于大多数生物药品来说，冷冻干燥都是它们生产过程的一项极为重要的制剂手段。根据1998年的统计，约有14%的抗生素类药品需要冻干，约有92%的生物大分子类药品需要冻干，约有52%其它生物制剂需要冻干。实际上，近年来开发出的生物药品都是运用冷冻干燥制成药剂的；而且冷冻干燥处于制药流程的最后阶段，它的优劣对药品的品质起着关键的作用。
3.新剂型药物和生物药品冷冻干燥的基本程序 • 药品准备和预冻 为了有利于干燥和冻干后能形成稳定的多孔结构，药品溶液必须保持一定的浓度。对于激素、酶、疫苗等剂量相对较小的热敏型药品，为了增加冻干品结构的牢固和外观的平整，大多需要添加赋形剂。对于大分子生物蛋白类药品或具有生物膜结构缓释类药品，为防止冻干过程中蛋白质的变性或膜结构的破坏，需要加入适当的冻干保护剂。 药品预冻终了温度，要低于药品溶液的玻璃化转变温度Tg或共晶点温度Te。 • 一次干燥过程（升华干燥过程） 冻结层的温度要低于共晶点温度Te或玻璃化转变温度Tg ；干燥层的温度要低于塌陷温度Tc。
二次干燥过程（解吸干燥过程） 干燥层的温度要低于塌陷温度Tc或玻璃化转变温度Tg。 • 装封过程 一般可在冻干室内直接利用加塞系统，把瓶塞压紧；也可通过向冻干室内充入氮气后进行密封包装。
4.生物药品冷冻干燥的关键问题 1） 干燥过程物料温度的控制和对干燥进程的判断 • 在干燥过程中，物料温度的确定和控制是十分重要的。若药品物料温度过高，物料会出现熔融、塌陷或皱缩问题；但若药品物料温度过低，不仅增加了制冷系统的负担，耗费更多能量，而且极大地降低了升华速率。 • 对于一次干燥过程与二次干燥过程的判断也是十分重要的问题。若一次干燥过程过早地进入二次干燥过程，将导致物料溶化；但一次干燥时间过长，耗时、耗能太大。二次干燥过程过早结束，残余水分会过高，样品无法长期贮存；但二次干燥时间过长，不仅耗时、耗能，而且有会使物料中的活性成分因过度脱水而变性失活。
预冻过程中的降温速率 • 在水溶液的冻结过程中，先出现冰；当溶液温度降至共晶温度时，溶质才开始析出。在原先冰晶的形成与生长的情况下，溶质的析出形成了网状结构。不同的物料、不同降温速率，冰晶形成的大小不同，溶质形成的网状结构也不同；由此造成不同的升华速率、和干燥后物料的不同。所以说，预冻过程在很大程度上决定了干燥过程的快慢和冻干产品的质量。 • 不同生物制剂最佳的降温速率各不相同。如蛋白多肽类药物的冻干，慢速冻结通常是有利的；而对于病毒、疫苗快速降温通常是有利的；然而对于脂质体药物，较快或较慢的降温速率均不利。
3）冻干保护剂种类与浓度 不同生物制剂中活性成分的分子结构各不相同，所要求的冻干保护剂种类与浓度也各不相同，保护剂的种类与浓度决定着冻干产品的有效性和稳定性。到目前为止，还没有找到一种通用的冻干保护剂，能适用于各种生物制剂的冻干。 生物药品冻干常用的冻干保护剂
5.冷冻干燥生物药品可能产生的变性及其防止 • 关于在冻干过程中蛋白质变性的一种学说为“界面变性”假说。假说认为：药品中蛋白的变化程度与冰晶与蛋白分子接触的界面总面积有关。接触界面面积越大，蛋白药品在冻干过程中活性损失越大。用“界面变性”假说可以解释以下几个关于蛋白质冻干中常见的现象。 • 1）快速冻结大多对蛋白类药品冻干不利，是因为快速冻结过程中，冰晶与冻结浓缩的溶液间界面面积增大，使变性蛋白质量增大。 • 2）低温回火常有利于蛋白类药品的冻干，是因为低温回火促使冰晶生长，冰界面面积减小。
3）冻干过程中浓度较高的蛋白溶液冻干后稳定性相对较好，是因冰界面处蛋白处于饱和状态。蛋白结构链伸展较少。3）冻干过程中浓度较高的蛋白溶液冻干后稳定性相对较好，是因冰界面处蛋白处于饱和状态。蛋白结构链伸展较少。 • 4）表面活性剂有利于蛋白类品药的冻干，是因为表面活性剂占据了冰界面处蛋白的位置，减少了冰晶与蛋白间的界面面积。
6.3 纤维蛋白原的冷冻干燥1. 纤维蛋白胶-纤维蛋白粘合剂 纤维蛋白胶又称纤维蛋白粘合剂。临床研究资料表明，纤维蛋白胶能快速有效控制外科手术过程中血液的流失，尤其在控制缓慢出血，体液渗出，针线处渗血，淋巴液渗出及实质性脏器的出血等方面具有显著特点。在临床手术和内窥镜治疗中有极高的实用价值和广阔的应用前景。目前它在组织相容性、无毒性和临床有效性等方面的性能优于其他任何一种生物或人工合成的外用止血剂。 动物试验证实纤维蛋白胶具有五个主要的药理作用：①止血作用；②粘合加固作用，并促进缝合伤口的愈合；③封闭体内空腔及促进神经修复；④粘附作用，提高皮肤移植成功率；⑤减少渗出液，抗粘连作用。
目前，美国Immuno公司的纤维蛋白胶要求贮藏在2-8℃，而不是常温；国内有的纤维蛋白胶产品，在常温下的贮藏期不到一个月；有的纤维蛋白胶产品完全复水的时间长达30分钟，不能满足临床应用的要求。目前，美国Immuno公司的纤维蛋白胶要求贮藏在2-8℃，而不是常温；国内有的纤维蛋白胶产品，在常温下的贮藏期不到一个月；有的纤维蛋白胶产品完全复水的时间长达30分钟，不能满足临床应用的要求。 • 临床应用需要冻干的纤维蛋白原复水时间短，贮藏稳定性好。我们和解放军海军411医院药学专科中心一起对纤维蛋白原的冷冻干燥进行了研究。
2.纤维蛋白原 • 纤维蛋白原是纤维蛋白胶二元成份之一。由两个相同的亚基组成，每个亚基均含Aα、Bβ和γ三条肽链。 • 纤维蛋白胶的作用机制是在凝血酶（thrombin）的作用下，纤维蛋白原(纤原)分子裂解出纤维蛋白肽A和肽B，导致纤维蛋白单体形成；同时凝血酶也激活因子Ⅷ（factor Ⅷ），因子Ⅷ参与纤维蛋白的交叉联结，使纤维蛋白形成稳定的、非脆性凝块。 • 纤维蛋白原是一种水溶性活性蛋白，溶液状态下不稳定，易氧化变质，长时间放置会凝沉、变黄；纤维蛋白原热稳定性差，受热易变性。生产过程中，纤维蛋白原需进行冷冻干燥，然后在真空下密封保存。
3.纤维蛋白原的冷冻干燥 1) 纤维蛋白原的制备 • 血浆的制备： 取抗凝剂(3.8%柠檬酸钠+0.9%氯化钠+水)5000ml，加入庆霉素500万； 加入新鲜猪血45000ml，与上述液体充分混匀； 低温2~4℃下静置，至血细胞沉淀，分界面出现； 取分界面之上清液，2-4℃下3000rpm离心30分钟；取离心上清液； 上清液置于-30℃冰柜，完全冻结，颜色红中泛白，以备纤维蛋白原的提取。 • 纤维蛋白原的提取 将冻好的血浆从低温冷柜中取出，在2~4℃下解冻； 解冻血浆在2~4℃下静止2小时，滤网粗滤后1000rpm离心10分钟； 弃上清留沉淀，计沉淀体积； 加等量的纤原清洗液 (清洗液：柠檬酸钠1.53g/L+氯化钠0.79g/L+甘氨酸2.3g/L+葡萄糖3g/L，pH=6.3)； 在2~4℃条件下，1000rpm离心10分钟； 弃上清，留沉淀，计沉淀体积，沉淀主要成分即为纤维蛋白原。
2）纤维蛋白原冷冻干燥的温度程序 • 冻结过程分三步，首先将搁板温度迅速冷却至-5℃，维持20分钟后，再迅速降低搁板的温度至-50℃，等待样品温度降至-45℃并维持1小时后，开始进入一次干燥过程；起动真空系统，待真空度下降至20Pa后，提升搁板温度至-10℃，持续约65小时后，进入二次干燥过程；提升搁板温度至+5℃，持续5小时后，将搁板温度提升至35℃，持续4小时，结束干燥过程，在真空下压盖密封，取出等待检验。
3) 纤维蛋白原冷冻干燥的冻干保护剂 • 冻干溶液配制过程中，冻干保护剂选用蔗糖、甘氨酸或甘露醇的单元、双元或多元组合。蔗糖是一种抗冻剂，在冻干过程中可有效地保护组织或蛋白质分子结构免受冰晶的损伤；而且其冻干后具有相对较高的玻璃化转变温度，可提高产品贮藏的稳定性；甘氨酸和甘露醇是一种填充剂，共晶点温度相对较高，可有效地保持样品冻干过程中的形状，减少样品的的皱缩，提高冻干速率，缩短冻干时间。 • 柠檬酸钠溶液与PBS溶液均为常用的缓冲溶液。文献报道，与PBS作缓冲溶液相比，檬酸钠(sodium citrate)溶液作缓冲溶液，冻干后具有较高的玻璃化转变温度，产品贮藏稳定性好。 • 还加入了一定量的氯化钠和吐温80 (Tween 80：聚山梨醇脂)。氯化钠是使溶液具有一定的离子强度；吐温80作为一种表面活性剂，都是用于防止蛋白类药品冻干过程中蛋白分子间的聚合。
不同纤原浓度、不同保护剂浓度、不同pH的缓冲溶液(不同浓度的柠檬酸钠溶液或PBS溶液)下配制出的样品。不同纤原浓度、不同保护剂浓度、不同pH的缓冲溶液(不同浓度的柠檬酸钠溶液或PBS溶液)下配制出的样品。
4 纤维蛋白原冻干样品的复水性与稳定性研究 1） 复水性能的研究 • 室温（20℃—28℃）下，用针管抽取2ml，PH=6.9，浓度为0.2 mol的PBS缓冲溶液，注入上述真空压盖后的冻干样品的西林瓶中；旋转针头，消除真空，轻微摇动后静置，计完全溶解的时间。 • pH值是影响样品复水性的一个重要因素，当缓冲溶液pH值在8.2附近时，可得到复水性相对较好冻干产品； • 用PH=7.9浓度为0.2mol PBS缓冲溶液，不如采用浓度为4mg/ml的柠檬酸钠溶液做缓冲溶液的冻干样品复水性能好；
2) 样品稳定性的初步实验研究 冻干残余水分含量测定的方法为卡尔费休法，稳定性加速实验设备采用恒温箱，变性程度靠样品的颜色变化比较，当样品变性后，样品颜色由乳白色变为黄色直至深褐色。
以蔗糖和甘氨酸或甘露醇组成二元冻干保护剂可有效提高冻干产品的稳定性与复水性，蔗糖浓度是影响冻干产品稳定性重要因素，冻干前纤原溶液内蔗糖浓度不宜低于3%。以蔗糖和甘氨酸或甘露醇组成二元冻干保护剂可有效提高冻干产品的稳定性与复水性，蔗糖浓度是影响冻干产品稳定性重要因素，冻干前纤原溶液内蔗糖浓度不宜低于3%。 • 甘氨酸或甘露醇可提高产品冻干过程中的稳定性，做为二元冻干保护剂之一，在提高冻干产品稳定性方面，甘氨酸较甘露醇好；在提高冻干产品复水性方面，甘露醇较甘氨酸好。 • 以4%柠檬酸钠缓冲溶液配制药品较PH为7.9浓度为0.2mol的PBS做为缓冲溶液配制纤原冻干溶液，所得纤维蛋白原冻干样品溶解较快，稳定性较好。
6.4 脂质体的冷冻干燥1.脂质体与脂质体药物 （1）脂质体 • 脂质体（liposomes）是由脂质双分子层组成的、内部为水相的闭合囊泡，具有生物膜的功能和特性，如：双亲性、流动性等。脂质体最初是由英国学者Bangham和Standish在60年代初将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中时能形成多层微囊，且每一层均为脂质双分子层，囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4nm，后来脂质体多指人工的脂质囊泡（artificial lipid vesicles）。脂质体根据其结构所包含的双层磷脂膜层数可分为单室脂质体和多室脂质体，含有单层双层磷脂膜的囊泡称为单室脂质体（unilamellar vesicles），含有多层双层磷脂膜的囊泡称为多室脂质体（multilamellar vesicles）。
脂质体的主要成分是磷脂，磷脂中最具有代表性的是磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline，PC），又称为卵磷脂。卵磷脂的来源有天然的、也有合成的。天然卵磷脂主要来自蛋黄和大豆，它们是构成许多细胞膜的主要磷脂成分，也是制备脂质体的主要原料，与其它磷脂相比，它的价格相对较低，化学性质也较稳定。合成卵磷脂有二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoyl phosphatidyl choline，DPPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（distearoyl phosphatidyl choline，DSPC）等。 • 磷脂分子中含磷酸基团的部分具有强烈极性，称为亲水基（head group），而磷脂分子中的两个长碳氢链具有非极性，称为疏水的非极性基团或尾基（tail group）。 • 由于这种典型的双亲分子特性，使脂质体具有亲油亲水性。因此脂质体作为药物的载体，其包裹范围是很广的，亲脂性药物、两性药物以及水溶性药物都可以被包裹。
脂质体的大小从直径25～1000nm，甚至更大。它们可由单层双分子膜组成，也可由多层双分子膜组成，不同的用途常要求特定大小的脂质体。一般粒径小于200nm的称为小单室脂质体（small unilamellar vesicles，SUV），粒径在200~1000nm的单室脂质体称为大单室脂质体（large unilamellar vesicles，LUV），多室脂质体（multilamellar vesicles，MLV）的粒径在1～5μm之间。 • SUV是具有脂质双分子层的最小单位，其大小根据介质的离子强度及膜的脂质不同而不同，一般在生理盐水中，单纯由蛋卵磷脂组成的脂质体粒径约15nm，由DPPC组成的粒径约25nm。SUV粒径分布较均匀，靶向性较强，但包封体积小，包封率低；LUV包封体积大，包封率高，但膜不够稳定；MLV是药物溶液被几层脂质双分子层所隔开形成不均匀的聚集体，其包封率较高，容易制备。
(2) 脂质体药物的特点 • 脂质体的靶向性。靶向性是脂质体作为药物载体最突出的特点。所谓靶向性指药物在体内具有定向分布的特性，体内网状内皮系统的吞噬细胞能吞噬大部分进入循环的脂质体，因而它们可视作“天然”的靶子，在肿瘤治疗中，若肿瘤细胞呈现出吞噬功能，则脂质体在体内同样能靶向肿瘤细胞。正是由于脂质体具有靶向性的特点，其被广泛用于肿瘤的治疗和防止肿瘤的扩散和转移。 • 脂质体的长效作用（缓释性）。脂质体作为药物载体还具有长效作用。脂质体包封的药物在血液循环中的保留时间，多数要比游离药物长得多。不同的脂质体药物在体内的保留时间，可以从几分钟到几天，可以根据需要设计具有不同半衰期的脂质体作为长效的药物载体，使药物缓慢地从脂质体中释放出来，从而延长药物作用时间，提高治疗指数。
脂质体降低药物毒性。药物被脂质体包封后，主要被网状内皮系统的吞噬细胞摄取，在肝、脾和骨髓等网状内皮细胞较丰富的器官有较高浓度，而在心脏和肾脏中的累积量比给予游离药物时低得多。因此，如果把对心脏、肾脏有毒性的药物，尤其是对正常细胞有毒性的抗肿瘤药物，包封在脂质体中可以明显降低药物的毒性。 脂质体降低药物毒性。药物被脂质体包封后，主要被网状内皮系统的吞噬细胞摄取，在肝、脾和骨髓等网状内皮细胞较丰富的器官有较高浓度，而在心脏和肾脏中的累积量比给予游离药物时低得多。因此，如果把对心脏、肾脏有毒性的药物，尤其是对正常细胞有毒性的抗肿瘤药物，包封在脂质体中可以明显降低药物的毒性。 • 脂质体提高被包封药物的稳定性。实验证明，将一些不稳定或易氧化的药物包封在脂质体中，药物因受到脂质体双层膜的保护，可显著提高稳定性。
(3)脂质体药物应用中存在的问题 • 脂质体性质不稳定，易受pH值变化、环境中物质与包封的药物性质影响。由于性质不稳定，它在液体状态只能贮存几周时间。有的药品易于发生水解以及不能经受高温过程，当此药品与脂质体以液态形式贮存时，可能使药物失去药效。脂质体中的脂类物质多是支持细菌培养的最好培养基，因此液态脂质体易被细菌侵蚀变质。 • 脂质体结构受温度影响较大，在液体状态，脂质体在50℃以上的介质环境中，结构会变得不稳定，磷脂双分子链结构会受到破坏。磷脂是构成脂质体的主要膜材，但易氧化，氧化后不仅影响药物包封率，而且氧化后生成溶血磷脂危害机体。液态的脂质体是一种混悬液乳剂，在贮存过程中，脂质体易于发生凝聚、融合并导致其包容药物的泄露。 • 为了使脂质体和其包封的药物在常温下长期稳定地贮存，冷冻干燥技术近年来广泛用于制备冻干的脂质体药物。
2. 脂质体的制备 以制备5%（w/v）葡萄糖作冻干保护剂的脂质体为例： • 称取1.2g大豆卵磷脂（soybean lecithin）、0.6g胆固醇(cholesterol)、0.4g泊洛沙姆(poloxamer)放入喷雾器内，量取10ml氯仿（CHCl3）倒入喷雾器中，使喷雾器内的上述材料充分溶解； • 把2.0g葡萄糖(glucose)放入包衣锅内，通电后使包衣锅旋转； • 用盛有膜材（membrane materials）的喷雾器，向包衣锅内喷膜材，每10分钟喷两次，并用一暖风机吹向包衣锅，使膜材中的有机溶剂挥发；喷雾器中的全部膜材喷完，包衣锅继续运转20分钟后停止； • 把包衣锅内的已制成的脂质体取出，放入小瓶密封，并放在干燥器内保存； • 当需要使用时，加蒸馏水使悬浮液体积为40ml，这样便配制成葡萄糖浓度为5%（w/v）的脂质体悬浮液。按上述方法可以配制葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖其它浓度的脂质体悬浮液。
5.干燥前后脂质体粒径的变化 • 脂质体粒径的大小对其在体内的行为有着重要的影响,决定了其在体内与细胞作用的部位以及在体内的分布与吸收。如静脉注射条件下，小的脂质体能够很快到达肝细胞；中等大小的脂质体能在血液循环中保持相当一段时间；较大的脂质体则不能到达受药部位。TSM型超细颗粒粒度分析仪，测试了脂质体粒径 。 海藻糖浓度为15%的脂质体冻干后粒径分布
以海藻糖作保护剂的冻干脂质体粒径变化最小，保护效果最好；葡萄糖的粒径变化最大，保护效果最差。不同浓度的糖类物质的保护作用不同，对于海藻糖，浓度为10%对冻干脂质体的保护效果最好。而对于甘露醇、蔗糖、葡萄糖，它们的最佳浓度分别为15%、10%、5%。以海藻糖作保护剂的冻干脂质体粒径变化最小，保护效果最好；葡萄糖的粒径变化最大，保护效果最差。不同浓度的糖类物质的保护作用不同，对于海藻糖，浓度为10%对冻干脂质体的保护效果最好。而对于甘露醇、蔗糖、葡萄糖，它们的最佳浓度分别为15%、10%、5%。 海藻糖作保护剂的脂质体冻干后平均粒径比较
25% 冻干前 降温速率为20℃/min冻干后 20% 降温速率为1℃/min冻干后 15% 分布 % 10% 5% 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 粒径 d/μm 6.降温速率对冻干后脂质体粒径的影响 • 冻干前的脂质体囊泡平均粒径为281nm，降温速率为1℃/min的冻干脂质体，重新复水后囊泡平均粒径为456nm；降温速率为20℃/min的冻干脂质体重新复水后囊泡平均粒径为298nm。 经不同降温速率冻结的的脂质体在冻干后粒径分布
