ÁRAMLÁSI CITOMETRIA [FLOW CYTOMETRY, FACS (fluorescence activated cell sorting)]

1. ÁRAMLÁSI CITOMETRIA[FLOW CYTOMETRY,FACS (fluorescence activated cell sorting)] Különálló sejtek multiparametriás vizsgálatára alkalmas laboratóriumi eljárás Az áramlási citometria és citométer működésének elve. A minta preparálása. A sejtpopuláció azonosítása méret és granuláltság szerint, scatter plot. Immunfenotipizálás, fluoreszcens jelölés, hisztogram, dot plot. Sejtfelszíni és sejten belüli antigének kimutatása. További alkalmazási területek: sorting, sejtciklus-analízis. Klinikai alkalmazási területek (példákkal): diagnózis, terápia és betegség progresszió monitorozása, prognózis. Gyakorló feladatok. PÁLLINGER ÉVA

2. FLOW CYTOMETRIA 105-106 SEJT / VIZSGÁLAT 1-2 MIN/ VIZSGÁLAT OBJEKTÍV (+/-) JÓ REPRODUKÁLHATÓSÁG AUTOMATIZÁLT MINTA ELŐKÉSZÍTÉS MIKROSZKÓPIA 102-103 SEJT / VIZSGÁLAT 4-5 MIN/ VIZSGÁLAT SZUBJEKTÍV (+/-) GYENGÉBB REPRODUKÁLHATÓSÁG IDŐIGÉNYESEBB MINTAELŐKÉSZÍTÉS A FLOW CYTOMETRIA ELŐNYEI

3. Mit mond el az áramlási citometria a sejtekről? • A relatív sejtméretet (Forward Scatter—FSC) • A sejtek relatív granuláltságát ill. belső komplexitását (Side Scatter—SSC) • A fluoreszcencia intenzitásukat

4. Hogyan működik az áramlási citométer? Folyadék rendszer: Biztosítja a sejtek áramlását, a sejteket a gerjesztés helyére fókuszálja Optikai rendszer: 1) fénygerjesztés: laser 2) az emittált fény eljuttatása a fotonsokszorozóhoz (PMT) Elektronikus rendszer: a fényjelek digitális jellé alakítása

5. Folyadék rendszer Flow cell (áramlási cella) lasersugár Hidrodinamikus fókuszálás sheath flow (burok folyadék ) Minta áramlás Minta felvételi pont

6. Optikai rendszer A dikroikus filterek szelektíven engedik át a fényt. A fénysugár irányításában és a PMT-be jutó fény „kiválasztásában” van szerepük.

7. BD Facs Calibur

8. Milyen kérdéseket tehetünk fel egy áramlási citométernek? Azonosíthatók a sejtpopulációk a vizsgálati mintában? (heterogenitás) Meghatározható a sejtek aktiváltsági, differenciáltsági és érési stádiuma? Jellemezhetjük a sejtek funkcionális állapotát? Meghatározhatjuk a sejtek abszolút számát a mintában? Detektálhatjuk quantitatív módon különféle szolubilis fehérjék jelenlétét a mintában? Fizikailag elválaszthatjuk (szeparálhatjuk) a sejteket egymástól? Válasz: IGEN

9. Milyen paramétereket használhatunk a kérdéseink megválaszolására? Relatív méret és granuláltság (FSC/SSC) Fluoreszcens jelek a sejtfelszínről és/vagy a citoplazmából Fluoreszcens jelek időbeni detektálása

10. MEGFIGYELÉSI MÓDOK FESTETLEN VIZSGÁLATI MINTÁK ANALÍZISE (sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint) FESTÉS FLUROKRÓMMAL JELZETT MONOKLONÁLIS ANTITESTEKKEL = IMMUNFENOTIPIZÁLÁS(sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapján) SEJTALKOTÓRÉSZEKHEZ SPECIFIKUSAN KÖTŐDŐ FESTÉKEK ALKALMAZÁSA Sejtszuszpenzió!!!

11. Mintaelőkészítés • Sejtszuszpenzió készítés • Alvadt vérből (alvadékos vérből) nem lehet mérést végezni! • Erythrolysis • Festés (ha szükséges) • Sejtalkotórészek közvetlen jelölése • Immunfenotipizálás

12. Minőség ellenőrzés • Technikai • A készülék beállításának és állapotának ellenőrzése (napi és időszakos) • Fluoreszcencia kompenzáció • Biológiai • A mintaelőkészítés ellenőrzése (pozitív és negatív kontrollok használata) • Izotípus ellenanyag jelölés • Autofluoreszcencia detektálás

13. Fényszórási jellegzetességek Right Angle Light Detector (Side scatter parameter = SS)Granuláltság Forward Light Detector (Forward scatter parameter == FS)Sejtméret Light Source (LASER)

14. Sejtmegoszlás méret és struktúráltság szerint Eosinophil granulocyta Neutrophil granulocyta Monocyta Lymphocyta Basophil granulocyta granuláltság méret

15. Sejtpopulációk azonosítása méret és granuláltság szerint egészséges csontvelő Milyen eltérést lát a képen,mi okozhatja?

16. O HO  = 488 nm = 520 nm C Fényenergia kibocsátottfluorescensfény CO2H FluorescensMolecula Antitest Mi is aza fluoreszcencia? A fluorochrom energiát vesz fel a laser fényből (gerjesztődés) A fluorochromokkibocsájtjáka felvett energiát: A kibocsátott fény hullámhossza nagyobb, mint a gerjesztő fényé

17. Fluorescein isothiocyanate peridinin chlorophyll A protein R-Phycoerythrin 100% Allophycocyanin FITC APC RPE PerCP Normalized Intensity 0% 600 400 500 700 800 A kibocsátott fény hullámhossza függ: 1) a fluorokróm típusától, 2) a fluorokróm környezetétől Wavelength (nm) Emissziós spektrum

18. FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Sejtszám Fluoreszcencia intenzitás (log) FluoreszcenciaAz emittált fluoreszcencia intenzitás arányos agerjesztett festék molekulák számával

19. Felhő kép (Dot plot) A fluoreszcens jelek grafikus megjelenítése Hisztogram

20. SEJTTÍPUSOK Cluster of Differentiation = CD(Differenciálódási markerek) 1. Leukocyta szubpopulációk azonosítása 2. Leukocyták érési / funkcionális állapotának meghatározása „Az immunológia alapjai” TK Függelék 1. táblázat

21. Differenciálódási markerek FELHASZNÁLÁSA AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK VIZSGÁLATÁBAN:IMMUNFENOTIPIZÁLÁS MÓDSZEREK:ÁRAMLÁSI CITOMETRIA IMMUNHISZTOKÉMIA

22. Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni és/vagy a citoplazmatikus fehérjemintázat alapjánIMMUNFENOTIPIZÁLÁS • Expresszió: IGEN (+) vagy NEM (-) • A „pozitív” és a „negatív” populációk %-os megoszlása • A sejtek relatív fehérje expressziója • Koexpresszió Megválaszolható (biológiai) kérdések:

23. Lymphocyta alcsoportok CD3- CD56+ Ly NK CD3+ CD56+ CD3+ CD19+ NKT T B1 CD5+ B CD3+ CD4+ B2 gdT Tc Th Plazmasejt CD3+ gdTCR+ CD4- CD8- CD3+ CD8+ ic könnyűlánc+ Th17 Th2 Treg Th1 IL-17+ TGFb+ IL4+ IL-5+ IL-10+ IL-13+ CD4+ CD25high+ Foxp3+ IFNg+ IL-12+ TNFa,b+ Funkcionális és morfológiai (immunfenotípus) kategóriák

24. „Igen-nem” válasz • Jelen van-e a vizsgálati mintában a keresett sejttípus? • Mekkora arányban van jelen? • Mekkora az abszolút mennyisége?

25. lymphocyta CD4high+ monocyta CD4dim+ Sejtfelszíni antigén expresszió mértéke Azonos mértékben expresszálják-e a vizsgálati minta sejtjei a keresett fehérjét? Mire lehet következtetni az expressziós eltérésekből?

26. IMMUNFENOTIPIZÁLÁS CD3-/CD8+ CD3+/CD8+ CD3-/CD8- CD3+/CD8- Milyen sejttípusba tartozhatnak a kettős negatívan festődő sejtek?

27. KLINIKAI PÉLDA AZ IMMUNFENOTIPIZÁLÁSRA

28. Eset leírás: 36 éves férfi minimális traumát követően felkar törést szenvedett. Gyakran fáj a háta, időnként lázas is. Testsúly mérsékelten csökkent az utóbbi időben, változatlan táplálkozási szokások mellett. Fizikális vizsgálat: a láz és a hátfájdalom eredetére utaló jel nem észlelhető. RTG vizsgálat: diffúz osteoporosis a gerinc háti szakaszán Laboratóriumi vizsgálatok: anaemia,hypercalcemia, monoklonális paraprotein.  Iránydiagnózis: Myeloma multiplex  Javasolt a csontvelő vizsgálata: kenet, FACS csontvelő Myeloma multiplex:a plazmasejtek daganatos megbetegedése

29. B SEJTVONAL DIFFERENCIÁLÓDÁSI ANTIGÉNEK CD34+ ckit (CD117) + HLA-DR+ TdT+ lymphoid progenitor Éretlen B Érett B Pre B Aktivált B Plazmasejt Pro B CD19+ CD20+ CD21+ CD22+ sIgM+/sIgD+ HLA-DR+ FcR+ CD11b+ CD19+ CD20+ CD21+ CD22+ sIg+ HLA-DR+ FcR+ CD11b+ CD19- CD45- CD38+ sIg- ic k+ v. ic l+ HLA-DR+ CD34+/- CD19+ CD20+ CD10+ ic CD22+ ic m + HLA-DR+ TdT+ CD19+ CD20+ CD21+ CD22+ sIgM+ CD34- CD10- HLA-DR+ TdT+ CD34+ CD19+ CD10+/- ic CD22+ HLA-DR+ TdT+ periféria antigén-függő csontvelő antigén-független

30. KONSZENZUS PROTOKOLL CD45/CD14 CD45/CD38/HLA-DR CD45/CD138 CD10/CD5/CD19 CD34/CD33/CD19 CD22/CD20 Kappa/Lambda/CD19 intracelluláris kappa/lambda CD4/CD8/CD3 A Myeloma multiplex diagnosztikája FACS módszerrel

31. CD45/CD38 jelölés Csontvelő (FACS) CD38 pozitív CD45 negatív Nagy méretű sejtek

32. CD45/CD138 jelölés CD45 negatív CD138 pozitív Nagy méretű sejtek

33. Sejtfelszíni k/l/CD19 jelölés

34. Citoplazmatikus k/l jelölés Citoplazmában sok l Nagy méretű sejtek Immunfenotípus: CD45-/CD19-/CD38+/CD138+/iclambda+: plazmasejt

35. CD4+/CD25high+ CD4+/CD25+ Sejtpopulációk azonosítása a sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásávalKLINIKAI PÉLDA AKTIVÁLT Th SEJTEK REGULATÓRIKUS T SEJTEK

36. 2.vérvétel 1. vérvétel Izotípus kontroll 1. vérvétel 2. vérvétel A sejtfelszíni fehérjék szemikvantitatív meghatározásának klinikai jelentősége A monociták HLA-DR expressziójának csökkenése rossz prognózist jelent szeptikus állapotokban.

37. Technikai vonatkozások Kalibrációs görbe M1 * y = 1,0076x – 1,6642 r2 = 0,999

38. Immunfenotipizált sejtek további vizsgálati lehetőségei:sejtszeparálás („sorting”)

39. „WASTE” „WASTE” SZEPARÁLT SEJTEK ÁRAMLÁSI CELLA ÁRAMLÁSI CELLA MINTA MINTA Mechanikus szortolás

40. ELEKTROMOS TÖLTÉS KONDENZÁTOR ÁRAMLÁSI CELLA SZEPARÁLT SEJTEK 1 SZEPARÁLT SEJTEK 2 „WASTE” MINTA Elektrosztatikus szortolás

41. Csontvelő CD34+ sejtek HDC expresszió RNS izolálás Sejtpopulációk jellemzése sejtszeparálás után KUTATÁSI PÉLDA

42. Sejtalkotórészekhez specifikusan kötődő festékek alkalmazása

43. „S” fázis emelkedés malignus sejtekben SEJTCIKLUS ANALÍZIS:PI festés Propidium jodid (PI) a kétszálú DNS-hez és RNS-hez sztöchiometrikusan kötődő fluorokróm. Alkalmazásával lehetőség nyílik a nekrotikus, az apoptotikus és az ép sejtek elkülönítésére. Klinikai jelentőség: malignus sejtek osztódási képességének jellemzése

44. A flow cytometria klinikai alkalmazása

45. Klinikai megközelítés Diagnózis Terápia monitorozás Prognózis Pathológiás állapotok aktivitásának nyomonkövetése

46. Rutin vizsgálatok célja Sejtarányok és abszolút sejtszámok meghatározása Pathológiás sejtek kvalitatív és kvantitatív analízise Aktivációs markerek kimutatása Sejtciklus vizsgálatok Sejtek funkcionális jellemzése

47. A flow cytometria helye a rutin klinikai gyakorlatban HEMATOLÓGIAI KÓRKÉPEK IMMUNHIÁNYOS ÁLLAPOTOK Autoimmun betegségek HLA-asszociált betegségek Fertőzések

48. A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN

49. A malignus haematológiai betegségek diagnosztikája Klinikai tünetek Morfológia Quantitativ és qualitativ vérkép Csontvelő kenet ill. biopszia Cytokémia Flow cytometria, immunhisztokémia Cytogenetika, molekuláris genetika

50. A FLOW CYTOMETRIA HELYE A HEMATOLÓGIÁBAN • DIAGNÓZIS / DIFFERENCIÁL DG. • MARADÉK LEUKAEMIA (minimal residual disease) • BETEGSÉG KIÚJULÁS (recidiva) • CHEMOTHERÁPIA MONITOROZÁS • MULTIDRUG REZISZTENCIA