Digital Imaging

1. Digital Imaging

2. Digital image - definition • Image = “a two-dimensional function, f(x,y), where x and y are spatial coordinates, and the amplitude of f at any pair of coordinates (x, y) is called the intensity (gray level of the image) at that point. When x, y, and the amplitude values of f are all finite, discrete quantities, we call the image a digital image.” (Gonzalez and Woods).

3. Analog to digital conversion • הדמות המתקבלת לאחר האופטיקה היא אנלוגית, כלומר התפלגות רציפה של הסיגנל במרחב. • לשם נוחות אנו מעוניינים להפוך את הדמות לדיגיטלית, כלומר בדידה.

4. Analog to digital conversion • הדמות המתקבלת לאחר האופטיקה היא אנלוגית, כלומר התפלגות רציפה של הסיגנל במרחב. • לשם נוחות אנו מעוניינים להפוך את הדמות לדיגיטלית, כלומר בדידה.

5. Analog to digital conversion • התמונה הדיגיטלית מורכבת ממערך של פיקסלים המייצגים ערכי עוצמה ומסודרים בקורדינטות מרחביות. • ההמרה מאנלוגי לדיגיטלי מתבצעת בשני שלבים: • Sampling – התהליך בו הופכים לדיגיטלי את המידע המרחבי. • Quantization – התהליך בו המידע על ערכי המשרעת באותם קורדינטות מרחביות הופך לדיגיטלי

6. Image map

7. Image map 512 0 255 512

8. Image resolution Image resolution is a measure of the degree to which the digital image represents the fine details of the analog image recorded by the microscope. • האיכות (רזולוציה) של התמונה הדיגיטלית נקבעת ע"י שני גורמים: • Spatial resolution - המספר הכולל של הפיקסלים בתמונה. • Grayscale/Brightness range/Bit-depth - טווח ערכי הבהירות האפשרי לכל פיקסל.

9. Spatial resolution ככל שמספר הפיקסלים ליחידת שטח גדל, גדלה הרזולוציה המרחבית. • המצב האופטימאלי הוא כאשר מתאימים את תדירות הדגימה (sampling frequency) לרזולוציה של הדמות המתקבלת מהמיקרוסקופ.

10. Spatial resolution The Nyquist criterion המרחק בין כל דגימה (sampling interval) צריך להיות לכל היותר חצי מהרזולוציה האופטית. ע"מ לקבל תמונות באיכות גבוהה, רצוי שיהיו 2.5-3 דגימות לרזולוציה האופטית. דוגמה: אם הרזולוציה של המיקרוסקופ היא 0.22 מיקרון ואני סורק 512 פיקסלים, שדה הראיה המקסימלי יהיה כ-56 מיקרון (512x0.11). שדה הראיה האופטימלי יהיה כ-37 מיקרון (512x0.22/3).

11. 128 x 128 64 x 64 Spatial resolution Changing the resolution of the image without changing bit-depth 512 x 512 256 x 256

12. Brightness - Bit depth • בתהליך הקוונטיזציה אנו ממירים את עוצמת הגוון הרציף של הדוגמה לערכי בהירות דיגיטליים. • הדיוק של הערכים הדיגיטליים פרופורציוני ל-bit depth.

13. Gray level - Bit depth Gray level resolution is a term used to describe the binning of the signal rather than the actual difference we managed to obtain when we quantized the signal. 8-bit and 16-bit images are the most common ones, but 10- and 12-bit images can also be found. 20=1 21=2 0,1 Black and White Image 22=4 28=256 0,1,2, …. 255 256 Grey LevelsImage 210=1024 בכל המקרים 0 מייצג לבן והערך הכי גבוה מייצג שחור. כל הערכים שבתווך מייצגים רמות שונות של אפור. 214=16384 216=65536

14. Bit depth Black and White (1 bit per pixel( 16 Greys (4 bits per pixel) 256 Greys (8 bits per pixel)

15. Low level Processing - Grey level display Eye has limited ability to distinguish grey levels/colours Above 32 grey levels images look smooth - 16 and below grey levels eye perceives objectionable banding = false contours. False contouring due to insufficient grey levels http://www.lenswork.com/calibrate.htm#tones_t

16. Bit depth Changing the bit-depth of the image without changing spatial resolution 8bit 4bit 3bit 2bit 1bit

17. Contrast •  a measure of changes in image signal intensity (ΔI) in relation to the average image intensity (I): C = ΔI/ I • the Rayleigh Criterion is not a fixed limit but rather, the spatial frequency at which the contrast has dropped to about 25 percent.

18. Signal to noise - definitions One of the most important limitations to image quality and image processing Signal S:N ratio = Variation in the signal Noise is NOT: background, auto-fluorescence or dark signal • Good image data has a high S:N ratio

19. Signal to noise – shot noise Statistics of photon counting dictate the minimum useful signal Average signal = 9, S:N ratio = 3 Average signal = 100, S:N ratio = 10 Average signal = 10,000, S:N ratio = 100 A meaningful difference in intensity needs to be at least three times the noise level Fundamental limit = Poisson distributed statistics of photon detection also known as Shot Noise shot noise is associated with the particle nature of light. n Poisson distributed variation: S:N ratio = √n Additional sources of noise: digitisation, detector readout, thermal noise.

20. Signal to noise – shot noise A photon noise simulation, using a sample image as a source and a per-pixel Poisson process to model an otherwise perfect camera (quantum efficiency = 1, no read-noise, no thermal noise, etc). Going from left to right, the mean number of photons per pixel over the whole image is (top row) 0.001, 0.01, 0.1 (middle row) 1.0, 10.0, 100.0 (bottom row) 1,000.0, 10,000.0 and 100,000.0.

21. Signal to noise – shot noise 1000 photons / pixel 100 photons / pixel 10 photons / pixel

22. Time and noise - tradeoffs The number of photons collected by the camera generally determines the amount of noise in your image Noise = square root (# of photons) Doubling signal to noise ratio requires 4-fold increase in exposure

23. Noise and resolution Theoretical perfect data Two spots separated by diffraction limit

24. Noise and resolution With shot noise 1000 ph/pixel at peak 100 ph/pixel at peak 10 ph/pixel at peak

25. Noise and resolution Expected error bars with shot noise 1000 ph/pixel at peak 100 ph/pixel at peak 10 ph/pixel at peak

26. Noise and resolution High resolution and precise quantitation both require lots of light This means bright samples or long exposures This may cause problems with photobleaching and phototoxicity Be aware of potential tradeoffs between precision, speed, and photobleaching

27. Signal to noise - take home messages • The definitions of noise components in image data are confusing. • Noise = variation in signal - you cannot simply subtract a “noise value”. • Noise is NOT dark signal or background but they CONTRIBUTE to image noise. • Dark signal = generated by camera • Has an average value component and a noise (variation) component. • Subtracting a dark offset value does not remove the noise component. • Background = autofluorescence of sample • Is a real fluorescence signal and has associated shot noise. • Subtracting an autofluorescence image does not remove the noise.

28. Presentation of 16-bit Image in OS Windows