CLEARANCE BLASTIQUE AU COURS DES LEUCEMIES AIGUES LYMPHOBLASTIQUE Gouider Emna

1. CLEARANCE BLASTIQUE AU COURS DES LEUCEMIES AIGUES LYMPHOBLASTIQUEGouider Emna

2. Leucémie aiguë lymphoblastique • Prolifération clonale maligne de cellules hématopoïétique malignes de type lymphoblastique. • > 30% de lymphoblastes au myélogramme • LAL- B • LAL-T

3. Rémission • Rémission:<5% de blastes au myélogramme • Rechutes fréquentes • Au dg: 1012 cellules leucémiques  Chimiothérapie induction • =Persistance de 1010 cellules leucémiques • Limites de la cytologie: seuil de 1 à 5%

4. Développement de la PCR et de la CMF • Seuil de détection est de 10-4 à 10-6 • 100 fois plus sensible que la cytologie

5. Maladie résiduelle en CMF • Sensibilité équivalente à la bio mol • Moindre coût • Disponibilité de la technique dans plusieurs laboratoires • Rapidité de résultats • Ne dépend pas de l’existence d’un transcrit • Corrélations avec le pronostic • Meilleur ajustement du traitement

6. Comparaison Biologie moléculaire/Cytométrie en flux

7. Cytométrie de flux • Grand nombre de cellules au dg • Mise en évidence d’ag de surface ou membranaire, Co-marquage • Recherche de ces cellules en cours de ttt • Possibilité de stockage des résultats et d’interprétation par divers intervenants

8. PrincipeCytométrie en flux Diode Laser FSC Miroirs dichroïques PMT SSC PMT FL2 Filtres FL1 PMT

9. Traitement des données Dénombrement des évènements dans une zone d’intérêt= Gating/Back Gating Visualisation: Histogramme/DotPlot Stockage des données : liste-mode

10. Gating CD45/SSC

13. Analyse d’un grand nombre de cellules une à une en peu de temps • Analyse simultanée de différents paramètres:Taille, Granularité, Ag membranaires,Ag cytoplasmiques,Ag nucléaires  Spécificité et Sensibilité • Conservation des données et interprétation par différents intervenants • Interprétation objective

14. CMF & MDR • Au diagnostic: Panel aussi complet que possible • Acquisition de 5000 à 10000 évènements • MDR: Choix d’une combinaison d’Ac en fonction du phénotype aberrant • Acquisition pour la MDR doit se faire sur un grand nombre d’évènements

15. Etude de la MRD en CMF • Détection d’un phénotype aberrant au diagnostic: • Expression de marqueurs my au cours d’une LAL • Asynchronisme d’expression antigénique • Intensité anormale

16. MO nle LA MRD

17. Gating cCD3+ CD19+ CD19+

19. QUAND ETUDIER LA MDR • En cours d’induction • En fin d‘induction • Avant traitement d’entretien • En fin de traitement

20. Phénotype aberrant absent dans 5 à 10% des LAL étude de nouveaux marqueurs • Existence de sous clones • Possibilité de swich phénotypique • Acquisition d’un très grand nombre d’évènements • Détails de l’analyse immunophénotypique au diagnostic

21. MDR en CMF et LAL de l’enfant

22. CORRELATIONS PRONOSTIQUES • La MRD en fin d’induction est corrélée au risque de rechute • La MDR en cours d’induction • Cinétique de clearance blastique

23. Blood, Vol. 96, Issue 8, 2691-2696, October 15, 2000Cumulative incidence of relapse in children with ALL according to MRD levels at the end of remission induction. All patients were in complete morphologic remission at the time of the MRD studies. Levels of MRD were defined by the percentage of mononuclear cells expressing leukemia-specific immunophenotypes.

24. Blood, Vol. 96, Issue 8, 2691-2696, October 15, 2000Cumulative incidence of relapse in children with standard-risk ALL according to MRD levels at the end of remission induction. All patients were in complete morphologic remission at the time of the MRD studies. Levels of MRD were defined by the percentage of mononuclear cells expressing leukemia-specific immunophenotypes.

25. Blood, Vol. 96, Issue 8, 2691-2696, October 15, 2000Cumulative incidence of relapse in children with high-risk (A) and low-risk (B) ALL according to MRD studies at the end of remission induction. Risk was defined by NCI criteria (see text for definition). All patients were in complete morphologic remission at the time of the MRD studies. MRD positivity is defined as 0.01% of mononuclear cells expressing leukemia-specific immunophenotypes.

26. Blood 2002 StJude Menmphis • 110 enfts ttés par la même CT • Ice cumulative à 5 ans d’échec ou de rechute: • 32.2%±6.5% pour 59 avec MDR+J19 • 6%±3.4% pour les 51 avec MDR-J19

27. Cumulative incidence of relapse in children with ALL, according to levels of residual disease (RD) on flow cytometric assessment on day 19 of remission-induction therapy. Levels of RD were defined by the percentage of mononuclear cells expressing leukemia-specific immunophenotypes. (A) Patients with an RD level of 0.01% or more (solid line) compared with patients with an RD level below 0.01% (broken line). (B) Cumulative incidence of relapse in patients with different levels of detectable RD.

28. Cumulative incidence of relapse in children with ALL, according to levels of residual disease (RD) on flow cytometric assessment on day 19  . Levels of RD were defined by the percentage of mononuclear cells expressing leukemia-specific immunophenotypes; the solid line indicates 0.01% or more, and the broken line, less than 0.01%. (A) Patients 1 year of age or older in whom leukemic cells lacked the Ph chromosome. (B) Patients with less than 1% lymphoblasts on morphologic analysis on day 19. (C) Patients who had clinical remission and less than 0.01% MRD at the end of remission-induction therapy (day 46).

29. MDR46 Facteur Pc indépendant • Mais 10% MDR46nég rechutent 106morph nég/110 LAL  74 MDR46 neg   48 MDR19nég 26 MDR19+

30. Valeur pronostique de MDR à J19 en CMF > morphologie • Valeur significative après ajustement des autres variables cliniques et biologiques • MDR- à J19 associée à une survie sans rechute plus que MDR à J46 • ~ ½ enfts MDR- après 2-3sem de ttt induction ont un excellent pronostic • Résultats comparables PCRJ15

31. Leukemia 2003 Stockholm 70 LAL (59B 11T)

32. MRD & LAL en rechute • Leukemia 2004 • 35 LAL en rechute

33. RC off therapy MRD + (n=12) Ice rechute à 2ans: 49,1% MRD neg (n=11) Ice rechute à 2ans: 0% RC on therapy 5 MRD nég 12/11 rechute  statut MRD

34. Hôpital Aziza Othmana • Labo Hémato : Septembre 2005 • 19 LAL au diagnostic: 15B et 4T • L’étude de la MRD est préconisée : • En cours d’induction (à J19 du traitement) si la moelle osseuse est non blastique à la cytologie. • En fin d’induction (J35 du traitement) • Avant le traitement d’entretien • En fin de traitement.

36. Au diagnostic: Panel large • Phénotype aberrant retrouvé dans tous les cas • Expression d’un Ag myéloide: 6 • Asynchronisme d’expression Ag: 4 • Intensité anormale: 16

37. Résultats très préliminaires • Taux MDR J19 5/7 62,5% • Taux MDR J35 11/16 68% • Taux MDR J35 LAL B 57% • Littérature taux MDR fin ind ~ 24-37% • Taux MRD J19 St Jude (134/248) 54% • Taux MRD+ en fin d’induction important • Recul insuffisant

39. Qualité du prélèvement: dilution!!! • Etre à deux pour les prélèvements • Ne pas dépasser 1cc • Acheminer le tube rapidement au laboratoire pour être techniqué le jour même (moins de cellules apoptotiques) • Collaboration étroite entre cliniciens et biologistes (renseignements cliniques+++) • Traitement: le protocole de chimiothérapie est-il respecté dans le temps? Dans les doses?.…..

40. MDR en CMF et LAL adultes • Signification (?) • Discordance avec PCR (ARN) • 2 Séries d’adultes ( 29 et 53): • 2 MDR consécutives > 10-3 = rechute • Série 40 LAL • MDR> 2. 10-2 corrélé à un taux de rechute important • Série de 110 LAL (adultes + adolescents) • MDR J35 corrélé au Pronostic • MDR J19 meilleur Pronostic

41. CMF & MRD • Dg IP LAL et MDR dans le même labo • Mêmes Ac • Même Cytofluoromètre • Même technicien • Au minimum un triple marquage

42. CONCLUSION • CMF : Technique séduisante • Corrélations pronostiques bien établies • Inclure le paramètre MDR dans les protocoles thérapeutiques ? • Toujours tenir compte des limites de la CMF dans le cadre d’étude de la MDR

43. Merci