Principe de de la résonance plasmonique de surface

1. Principe de de la résonance plasmonique de surface Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre deux milieux d'indice de réfraction différent, une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l'interface et l'autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface. Lumière polarisée monochromatique Lumière réfléchie Air Plaque de verre Liquide Lumière réfractée

2. Principe (suite) Selon l'angle d'incidence du faisceau toute la lumière peut être réfléchie. Lorsqu'il n'y a pas de réfraction, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l'onde évanescente, se propage perpendiculairement à l'interface sur une distance équivalente à sa longueur d'onde. Lumière polarisée monochromatique Lumière réfléchie Air Q Liquide Onde évanescente

3. Principe (suite) Si une couche fine de métal, riche en électrons libres est déposée à l'interface, ceux-ci entrent en résonance avec les photons du faisceau incident, ce phénomène est appelé résonance plasmonique de surface. Une conséquence énergétique de cette résonance est visible dans le faisceau réfléchi qui, analysé avec une barrette de diodes présente une chute d'intensité à un angle défini. Cet angle d'intensité minimum est l'angle de résonance. Il varie en fonction de l'indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent. Lumière polarisée monochromatique I Barette de diodes Lumière réfléchie Air Qi Plaque de verre Q Film d’or Liquide Onde évanescente

4. Principe de fonctionnement du Biacore Le Biacore a pour fonction de visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées dans un débit continu de tampon. Un des réactifs, le ligand, est retenu de manière spécifique sur une interface appelée sensor chip (biocapteur).

5. Le sensorgramme. L'analyte dilué dans un tampon circule à flux constant à la surface du biocapteur. Les changements de masse induits par l'association ou la dissociation des complexes modifient la réfringence du milieu et décalent la position de l'angle de résonance.L'enregistrement de la variation de l'angle de résonance permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur. Le signal de résonance est exprimé en unités de résonance (RU). L'enregistrement de ce signal s'appelle un sensorgramme.

6. Le cycle d’analyse en temps réel Ligand

7. Le cycle d’analyse Analyte

8. Le cycle d’analyse Phase d’association

9. Le cycle d’analyse Analyte + Ligand Complexe

10. Le cycle d’analyse Tampon Phase de dissociation

11. Le cycle d’analyse Analyse Mathématique Analyse cinétique de La liaison analyte - ligand

12. Le cycle d’analyse Agent régénérant Phase de régénération

13. Interactions en Temps Réel par BIACORE Molécules concernées protéines, acides nucléiques, sucres, lipides, petites molécules, drogues, peptides cellules, particules virales... Applications majeures Constantes d’affinités (KD=10-4 -10-12 M)et cinétiques (ka, kd) Concentration active d’un analyte Cartographie épitopique Validation de molécules recombinantes Détection de molécules (milieux complexes) Etude paramétrique Micropurification et récupération

14. Nature Biotechnology21, 71 - 76 (2003) Rational design of a CD4 mimic that inhibits HIV-1 entry and exposes cryptic neutralization epitopesLoïc Martin1, François Stricher1, Dorothée Missé2, Francesca Sironi3, Martine Pugnière4, Philippe Barthe5, Rafael Prado-Gotor5, Isabelle Freulon1, Xavier Magne2, Christian Roumestand5, André Ménez1, Paolo Lusso3, Francisco Veas2 & Claudio Vita1

15. Interaction protéine-virus : HIV MiniCD4 protéine mimétique (3kD) faite par synthèse peptidique à partir d’un fragment de toxine de scorpion donnant les caractéristiques structurales du CD4 Objectifs de l ’étude Etude des interactions entre gp120 et miniCD4 Démontrer que miniCD4 peut démasquer des épitopes neutralisants de la gp120 rec. et sur la gp120 native BIACORE • Martin L, Stricher F, Misse D, Sironi F, Pugnière M, Barthe P, Prado-Gotor R, • Freulon I, Magne x, Roumestand C,Menez A, Lusso P, Veas F and Vita C. (2003). • Nat Biotechnol 21(1): 71-6

16. STRUCTURE DU VIH core gp120 enveloppe P7 (nucléocapside) gp41 P24 (capside) intégrase P17 (matrice) RT ARN protéase 90 à 120 nm

17. HIV Lifecycle Rambaut A. et al. Nat. Rev. Genet. 5:52-61, 2004

18. Entrée du virus dans la cellule : 1re étape du cycle de réplication virale 1 Interaction entre le complexe trimérique de l’enveloppe et le récepteur CD4 • modification conformationnelle de la gp120 et de la gp41 • augmentation de 100 à 1 000 fois de l’affinité pour le corécepteur Cellules infectées ou exprimant des protéines de l’enveloppe virale Glycoprotéinesde l’enveloppe VIH CD4 CCR5 ou CXCR4 (corécepteur) Cellules cibles exprimant CD4 et corécepteur CROI 2003 - D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé

19. Les différentes étapes déclenchant la fusion 2 Fixation au corécepteur Fin de la modification conformationnelle de l’enveloppe Formation d’une structure en épingle à cheveux, hélicoïdale avec rapprochement des membranes Initiation de la fusion des membranes lipidiques Attachement cellulaire non spécifique Fixation au récepteur CD4 Initiation de la modification conformationnelle de l’enveloppe Cellule cible Corécepteur CD4 gp120 gp41 Virus Étapes possibles du blocage de l’entrée 3. Inhibition de la modification conformationnelle de la gp41 (fusion) 1. Inhibition de la fixation au CD4 2. Inhibition de la fixation au corécepteur - D’après E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé

20. Structure of HIV-1 gp120/CD4 Complex CD4 gp120 Blue: glycosylation sites

21. gp120 CD4 ARN viral Rétro Transcriptase ADN proviral ADN intégré protéines STRATEGIES ANTI-VIH : bloquer les étapes Inhibiteurs de la fusion Inhibiteurs de la RT Analogues nucléosidiques Non nucléosidiques Inhibiteurs de l’intégrase Inhibiteurs de la transcription ARNm Inhibiteurs de l’assemblage Inhibiteurs de protéase GC/VIH/99

22. Synthétiser une mini proteine qui mime CD4 et qui inhibe l’entrée de HIV dans la Cellule

23. Interaction protéine-virus :HIV interaction : gp120sur CD4M33 immobilisé Les gp120 se lient au CD4M33 Interactions Moléculaires en Temps Réel (M. Pugnière, F. Roquet) CNRS-UMR 5160 site CRLCC Val d’Aurelle

24. Interaction protéine-virus :HIV Le CD4M33 induit les changements de conformation de la gp120HXB2soluble ou de la gp120 portée par les particules virales nécessaires pour exposer les épitopes du 48D et du 17B. + CD4s ou M33 gp120WT-CD4 /48D -CD4 ou +M0 Part. virales+CD4 / 48D +M33

25. Conclusions --Elles amènent une quantification de l’affinité mais surtout des données cinétiques. -Etude des interactions à plus de deux partenaires -Etude paramétrique de ces interactions -Méthode applicable à grand nombre de molécules et aux interactions complexes -Récupération possible