实验十七（ 2 ）烟草原生质体融合

实验十七 （2）烟草原生质体融合一、原理 PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体吸水过程中，发生原生质体融合。

二、实验目的 学习植物原生质体融合的方法，为进行体细胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。三、实验材料和用具 1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛（=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离心管，血球记数板。

四、实验步骤 1、配制酶液各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。 CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶+0.5%离析酶

2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离 黑暗、 25℃酶解5~6小时，间歇轻轻摇动。 2～3周龄愈伤组织和叶片各约1g和0.5g，叶片剪成细条加入到酶液中、用镊子分散愈伤组织

3、过滤和离心洗涤原生质体 800rpm离心3min 过滤弃上清液弃上清液,重新悬浮在0.5ml CPW溶液中 800rpm离心3min 加入3ml CPW培养基，用滴管重新悬浮原生质体

4、原生质体融合 （1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体的密度调整为106个原生质体/ml。（2）配置PEG融合液（无菌下） PEG溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1 （3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体积混合。

（4）原生质体融合步骤 5min内缓慢加入5ml W5稀释液，轻轻吸打混匀取0.2ml混合原生质体悬浮液加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液静置10min 重新悬浮在0.5ml W5，静置>10min 800rpm离心3min，弃上清夜静置>30min

（5）融合原生质体的观察 吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融合率。融合原生质体的特征： A：异源融合；B：同源融合融合率=融合的原生质体数/观察的原生质体数

准备下次实验的试剂（各100ml）： （1）2×CTAB提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0），2％（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇，20mM EDTA （2）TE缓冲液：10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA。（3）50TAE电极缓冲液：称取24.2gTris溶解于适量蒸馏水中，加入5.7ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶液，定容到100ml。（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）（5）溶液III： 60 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 , 28.5 ml无菌水（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）

实验十七 （ 2 ）烟草原生质体融合