Monoklonális ellenanyagok

1. Monoklonális ellenanyagok • egyetlen B-limfocita klón termékei • homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus) • kiszámítható hatás, kevés mellékhatás - humán szervezetben patológiás körülmények között, plazmasejt klón malignus szaporulata miatt (myeloma multiplex) • előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben („pharmacology-grade”) állíthatók elő

2. egyetlen B-limfocita klón Monoklonális ellenanyag többB-limfocita klón Poliklonális ellenanyag

3. A poliklonális és monoklonális ellenanyagok jellemzői

4. Monoklonális ellenanyag előállítás menete Hibridoma technika Vázlatosan 1. • egér/patkány beoltása antigénnel • lép vagy nyirokcsomó eltávolítása, homogenizálása • lépből származó plazmasejtek + B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/mielóma sejtek) fúziója • Az ellenanyag termelő klónok azonosítása. A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatban feldúsul

5. Immunzálás Lép B sejtek, HGPRT+ Mielóma sejt HGPRT- PEG fúzió HAT szelekció Sejteket tartalmazó lyukak felülúszójának tesztelése Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan 2. A hibrid sejtek szelekciója aminopterin * HAT= hypoxanthin, aminopterin, thymidin *Hypoxantin-guanin foszforibozil transzferáz

6. (1) Egér immunizálása(2) B sejtek izolálása a lépből(3) Myeloma sejtek kinyerése(4) Myelomaés B sejtek fúzionáltatása(5) A sejtvonalak izolálása(6) A megfelelő sejtvonalak kiválasztása szűrőmódszerekkel(7) in vitro (a) vagyin vivo (b) sokszorosítás(8) Monoklonális antitest termeltetés

7. Monoklonális ellenanyag termelés hatékonyságát befolyásoló tényezők • Antigén specifikus B-limfociták aktiválása • - egér: beltenyésztett törzsek, genetikailag jellemzett, • beoltáshoz kevés antigén • - ellenanyagtermelőhibridsejtek kinyerésének hatásfokátbefolyásolja: • a) immunizálás módja (adjuváns, oltás helye:IP, talp, farokvéna, lép) • b) emlékeztető oltások száma • c) utolsó oltás és a fúzió között eltelt napok száma (2-4 nap) • 2. A fúziós partnerek • - BALB/c egérből származó Sp2/0-Ag14 tetraploid, • ellenanyagtermelő képességgel nem rendelkező plazmacitoma sejt • (anyagcseredefektussal rendelkezik, HGPRT (hipoxantin-guanin- • foszforibozil-transzferázés TimidinKinázhiány)

8. Monoklonális ellenenyagok felhasználási lehetőségei • Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása • Immunhisztokémia • Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével • Sejtek elválasztása • CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből • Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) • Komplex antigén keverékek analizálása • Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata • T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata • Célzott kemoterápia • CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtesNon-Hodgkinlymphomában • Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással • Gyógyszer-eliminálás antitestekkel • Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

9. Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek? Az emberi antigénekkel immunizált egérben termelt antitestek az egérre specifikus aminosav-szekvenciákkal bíró glikoproteineket jelentenek, tehát emberbe adva fajidegen fehérjeként hatékony immunválaszt indukálnak. Hogyan kerülhető meg a probléma?

10. Humán Egér Kiméra Humanizált A monoklonális antitestek fejlődése Antigén kötő régió Homológ régió

11. Monoklonális ellenanyagok „humanizálása” 1. CAMPATH-1H anti-CD52 monoklonális patkány ellenanyag Fajidegen ellenanyagok többszöri használata erős immunválaszt indukál. (Probléma: HAMA = humán anti-mouse antitestek) Ha a patkány immunglobulin antigénkötő régiójával cserélik ki egy humán ellenanyag homológ régióját, az így a keletkező ellenanyagban csak az antigénkötő régió lesz patkány eredetű. (Kiméra) (Probléma: HACA = humán anti-chimera antitestek, bár ezek kevésbé immunogének) 2. In vitro fág display: átrendeződött VDJ régiókat filamentózus fágok kapszidjának felszínén fejezik ki, majd a nagy affinitással kötődő fágokat antigén-affinitás oszlopkromatográfiával tisztítják. A fágból izolált humán Ig kódoló DNS-t transzgenikus egerekben expresszáltatják. 3. Olyan knock-out egerekben amelyekben az egér saját Ig génjét inaktiválták a humán „germ-line” (még at nem rendeződött) lokusz transzgénként kifejezhető. Így az egérben játszódik le a humán Ig gének átrendeződése és a humán Ig által „megmentett” egér B-sejtek antigének általi szelekciója. Az egér B-sejtekből amelyek human Ig-t termelnek hibridóma készíthető és nagy mennyiségű Ig állítható elő.

12. In vitro fág display Expresszált humán antitest Antitestet kódoló humán gének Átrendeződött VDJ gén Fág által kifejezett antitestek (Humán Ig-t kódoló DNS-t szeparálják, transzgén egérben termeltetik) Fág display vektor Gene3 Szelektív kötődés az antigénhez Amplifikálás Mosás

13. egér Ig „knock-out”, transzgén egér (humán Ig kódoló gének bejuttatása) VDJ átrendeződés a transzgén egérben

14. Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok - Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) • Immunszuppresszió Sejttípusra célzott immunszuppresszió lehetősége

15. Terápiás monoklonális antitestek elnevezése A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel (nem igényel tulajdonjogot) illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximabab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.

16. Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában • „Naked MAb”, nem konjugált antitest • Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma • Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) • Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor • Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) • Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) • 2. konjugált antitest • Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) • Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

17. Immunszuppresszív ellenanyagok 1. • Anti-TNF-α antitestek • infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra • adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán • Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje,TNF-α receptor + Ig Fc-vég • (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) • Anti-TNF-α terápia indikációi: • Rheumatoid arthritis • Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) • Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica • Crohn-betegség, colitis ulcerosa • (általában - még - nem 1. vonal!)

18. Immunszuppresszív ellenanyagok 2. • Muromonab-CD3 (OKT-3) egér IgG2a • CD3 pan-T sejt antigén ellen, szervátültetést megelőzően vagy követően alkalmazott immunszupresszív kezelésre; ma már ritkán használják (fajidegen fehérje!); humanizált változatával I-es típusú diabetes mellitusban folynak vizsgálatok • Omalizumab (Xolair): • IgE elleni humanizált IgG1k monoklonális antitest • Ind.: allergiás asthma, Churg-Strauss szindróma • Daclizumab (Zenapax): • IL-2 receptor elleni, humanizált antitest. • Ind.: transzplantációt követően kilökődési reakció ellen, T-limfocita aktivitás gátlására • basiliximab (Simulect): mint daclizumab, de kiméra! • efalizumab (Raptiva): anti-CD11a, humanizált, ind.: psoriasis

19. Regisztrált molekulárisan irányított szerek

20. További lehetőségek monoklonális ellenanyagok felhasználására • Radio-immunotherápia • Pl. Zevalin, Bexxar – monoklonális + izotóp • Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) • Az antitesthez enzimet kötnek, mely a később szisztémásan bevitt, ártalmatlan prodrug vegyületet lokálisan alakítja a citotoxikus, hatékony metabolittá • Immuno-liposzómák • Liposzómába csomagolt nukleotidok vagy gyógyszer célzása monoklonális antitestekkel (pl. tumorszuppresszor gének bevitele, szövetspecifikus génbevitel) • Nem immunológiai célpontú manipulációk • pl. abciximab (ReoPro): thrombocyta-aggregatio gátlása