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RT-PCR 实验方法简介. 杨文斌. RT-PCR 定义:. 是指对组织或细胞的总 RNA 进行抽提,把 RNA 反转录为 cDNA ,然后设计目的基因引物进行 PCR ,琼脂糖电泳并数码拍照,分析电泳条带灰度值,判断目的基因 mRNA 转录水平的相对量的变化。. RT-PCR 流程简介. 一、抽提 RNA :. 1 、防止 RNA 酶污染 180℃ 的高温下干烤 6hr 以上; 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗; 去污剂洗涤,双蒸水冲洗; 溶液皆用 0.1% DEPC 水配置,试剂应为新开封或 RNA 专用; 操作人员戴手套; 器械专用。.
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RT-PCR实验方法简介 杨文斌
RT-PCR定义: • 是指对组织或细胞的总RNA进行抽提,把RNA反转录为cDNA,然后设计目的基因引物进行PCR,琼脂糖电泳并数码拍照,分析电泳条带灰度值,判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。
一、抽提RNA: • 1、防止RNA酶污染 • 180℃的高温下干烤6hr以上; • 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗; • 去污剂洗涤,双蒸水冲洗; • 溶液皆用0.1% DEPC水配置,试剂应为新开封或RNA专用; • 操作人员戴手套; • 器械专用。
2、材料的准备 • 组织及细胞最好为新鲜的,或者在-70℃条件下保存半年以下; • 尽量避免材料的冻融 。
3、确认RNA的质量 • 检测RNA溶液的吸光度: OD260/OD280=1.8-2.0 • RNA的电泳图谱: 28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰,并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。
二、反转录: • 单管一步法 反转录和PCR反应在一个管子中完成 ,得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增 ,灵敏度更高,但是容易相互干扰 。 • 两步法 反转录和P CR分开做,PCR取反转录反应产物的1/10进行,更为灵活而且严谨,但是灵敏度不如前者高。
三、PCR: • 1、参照基因 PCR 参照基因一般选择看家基因(长表达、高表达量 的基因),常用18S、β-actin、bubulin、GAPDH,其中ACTIN最为普遍; 参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下,称之为内参; 参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参; 由于内参可能与目的基因竞争模板及酶,或造成其它干扰,外参的应用较为普遍。
2、目的基因 PCR 典型的引物18到24个核苷长,引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
RT-PCR实例: • 1、实验材料:拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序 • 2、实验目的:分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异 • 3、实验步骤: • 设计ACTIN及G1基因的引物; • 分别抽取野生型Ws及突变体m1、m2花序RNA,DNase I处理,以尽量去除基因组DNA; • 电泳检测,估计RNA总量; • 取1ug左右的RNA进行反转录;
取反转录好的cDNA总量的1/10(10ul反转录体积则取1ul),稀释10倍(稀释至10ul),取1/10(1ul)为模板,用ACTIN引物、普通PCR体系、20-25个循环、以基因组DNA为对照(因为引物跨内含子,所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同,以去除残留的基因组DNA的影响)做PCR;取反转录好的cDNA总量的1/10(10ul反转录体积则取1ul),稀释10倍(稀释至10ul),取1/10(1ul)为模板,用ACTIN引物、普通PCR体系、20-25个循环、以基因组DNA为对照(因为引物跨内含子,所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同,以去除残留的基因组DNA的影响)做PCR; • 取等量产物电泳,根据电泳条带的亮度调整模板量(如m1的亮度为Ws的2倍,则下次PCR时m1的模板为0.5ul),直到电泳亮度基本一致,可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。 • 以G1基因引物,按调好的模板体积做PCR,电泳。 • 根据电泳条带的亮度比较野生型Ws及突变体m1、m2中G1基因的表达差异。
谢 谢! 北京基莱生物科技研究中心 2006年12月 制作