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RT-PCR 实验方法简介

RT-PCR 实验方法简介. 杨文斌. RT-PCR 定义：. 是指对组织或细胞的总 RNA 进行抽提，把 RNA 反转录为 cDNA ，然后设计目的基因引物进行 PCR ，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因 mRNA 转录水平的相对量的变化。. RT-PCR 流程简介. 一、抽提 RNA ：. 1 、防止 RNA 酶污染 180℃ 的高温下干烤 6hr 以上； 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗； 去污剂洗涤，双蒸水冲洗； 溶液皆用 0.1% DEPC 水配置，试剂应为新开封或 RNA 专用； 操作人员戴手套； 器械专用。.

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RT-PCR 实验方法简介

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Presentation Transcript

  1. RT-PCR实验方法简介 杨文斌

  2. RT-PCR定义： • 是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。

  3. RT-PCR流程简介

  4. 一、抽提RNA： • 1、防止RNA酶污染 • 180℃的高温下干烤6hr以上； • 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗； • 去污剂洗涤，双蒸水冲洗； • 溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用； • 操作人员戴手套； • 器械专用。

  5. 2、材料的准备 • 组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下； • 尽量避免材料的冻融 。

  6. 3、确认RNA的质量 • 检测RNA溶液的吸光度： OD260/OD280=1.8－2.0 • RNA的电泳图谱： 28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。

  7. 二、反转录： • 单管一步法 反转录和PCR反应在一个管子中完成 ，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增 ，灵敏度更高，但是容易相互干扰 。 • 两步法 反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。

  8. 三、PCR： • 1、参照基因 PCR 参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量 的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍； 参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参； 参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参； 由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。

  9. 2、目的基因 PCR 典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

  10. RT-PCR实例： • 1、实验材料：拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序 • 2、实验目的：分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异 • 3、实验步骤： • 设计ACTIN及G1基因的引物； • 分别抽取野生型Ws及突变体m1、m2花序RNA，DNase I处理，以尽量去除基因组DNA； • 电泳检测，估计RNA总量； • 取1ug左右的RNA进行反转录；

  11. 取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－25个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR；取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－25个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR； • 取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。 • 以G1基因引物，按调好的模板体积做PCR，电泳。 • 根据电泳条带的亮度比较野生型Ws及突变体m1、m2中G1基因的表达差异。

  12. 谢 谢！ 北京基莱生物科技研究中心 2006年12月 制作

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