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Tetrahymena

Tetrahymena. Etudes de protéines durant un stress toxique par immunodétection. Buts à long terme. Comprendre les mécanismes moléculaires de réponse aux produits toxiques, chocs oxydatifs et autres "stress chimiques" Trouver des marqueurs potentiels de toxicité

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Presentation Transcript

  1. Tetrahymena Etudes de protéines durant un stress toxique par immunodétection

  2. Buts à long terme • Comprendre les mécanismes moléculaires de réponse aux produits toxiques, chocs oxydatifs et autres "stress chimiques" • Trouver des marqueurs potentiels de toxicité • Evaluation de la qualité de l'eau • Evaluation de la toxicité de produits chimiques • QSAR

  3. Objectifs du projet • Identifier la protéine 32 k par immunodétection • Déterminer les paramètres d'induction de cette protéine • Cinétique • Concentration de toxique • Type de toxiques • Synergie • Etc.

  4. Objectifs du projet (alternatives) • Identification par PCR • Identifier gène dans génome Tetrahymena • Définir sonde spécifique • Obtenir sonde • Développer protocole • Résultat négatif => ????

  5. Culture des cellules… • Culture stock • Culture de conditionnement • Culture de travail • Incubations

  6. Traitements… • Contrôle • Choc thermique • Toxiques/stress • Concentration, durée, cinétique • Toxiques, Stress oxydatif, inhibiteurs

  7. Incubations… • 2.5 x 105 cell/mL • Volume total : 1 mL • Durée: 45 min • Milieu culture: • Contrôle: • Aucun toxique = - • 34°C (choc thermique) = +

  8. Extraction des protéines… • SDS ou phénol

  9. Electrophorèse… • Système de Laemlli (SDS) • Gels 5%/12.6% • Electrobuvardage • Semi-sec • Nitrocellulose ou PVDF

  10. Immunodétection • Ab secondaire conjugué phosphatase alc. • Détection chromogénique ou chémifluorescence • Etalons: • Contrôle interne: actine • Ag: actine, 32k (rat),

  11. Autres protéines intéressantes • Métallothioénine • GRP76 • HSP….

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