一、目的学习和初步掌握稻、麦或棉的花粉生活力测定方法。

一、目的学习和初步掌握稻、麦或棉的花粉生活力测定方法。一、目的学习和初步掌握稻、麦或棉的花粉生活力测定方法。

二、内容说明作物杂交工作中，往往会遇到父母本花期不遇，必须采集花粉短暂贮藏，经贮藏的花粉及其生活力如何，必须经过测定，以保证杂交效果。此外，花粉的生物学研究，作物雄性不育和远缘杂交都要鉴定花粉育性和生活力。花粉生活力测定的方法较多，常用的有：形态鉴定、染色鉴定、花粉发芽鉴定。

形态鉴定： • 花粉有无生活力在形态上有明显差异，即形态是否发育正常，其内部淀粉等内含物是否充实。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物充实饱满，形状规则，大小整齐。因内部含有较多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易吸涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代花粉形态和育性的鉴定。

染色鉴定：用不同的化学试剂如氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride、C12H15N4Cl，简称TTC或四唑）、联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。 • 花粉发芽鉴定：配制一定浓度的蔗糖溶液等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验，根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。

三、所需用品和操作方法 • （一）用品 • 当天采集的稻、麦或棉任何一种作物的新鲜花粉。冰箱、荧光显微镜、普通显微镜、恒湿箱、载玻片、盖玻片、培养皿、滴管、镊子、解剖针、吸水纸、滤纸、标签、铅笔等。Na2HPO4、KH2PO4、K3PO4、NaOH、MnSO4、Ca（NO3）2、H3BO3、1%I-IK溶液、乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、苯胺蓝、冰醋酸、蔗糖、琼脂、马铃薯淀粉、蒸馏水。

三、所需用品和操作方法 • （二）操作方法 • 花粉的育性和生活力可由浅入深按以下顺序观察鉴定：外形观察→I—IK测定内含物的充实度→染色法鉴定花粉酶学性质→花粉发芽试验→观察花粉在柱头上萌发和伸长情况。

1、形态鉴定 • （1）在载玻片上置少量正常的稻、麦或棉的新鲜花粉，于低倍显微镜下观察花粉形态。不同育性和生活力的花粉在形态上有明显差异。水稻和小麦不育花粉空秕畸形，可育花粉饱满球形；棉花不育花粉呈半圆形和棒状，大小也参差不齐，可育花粉均为圆形，大小整齐一致。 • （2）与形态观察相同，但在有花粉的载玻片上滴1滴1%I—IK，再观察花粉是否染色和染色深浅情况，以判断花粉内含物的充实度。正常花粉应有较多的淀粉粒，遇I—IK呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。

2、染色鉴定 • （1）试剂配制：Sorensen磷酸缓冲液、 0.2%TTC溶液 • （2）TTC染色：取已成熟尚水开花的水稻、小麦或棉花花粉5—10个，切断花药两端，放入小烧杯中，加0.2%TTC溶液，使花药完全浸入反应液中，在30℃左右温度下染色30—60分钟。 • （3）压片镜检：取出花药，置于载玻片上，用解剖针压出花粉，去掉花药药壁组织，盖上盖玻片，镜检观察，取5个视野，统计着色花粉百分率。凡花粉粒变红有生活力，染色越深生活力越强。

3、花粉发芽鉴定 • （1）配制培养基 • 水稻称取马铃署淀粉6g、蔗糖20g、H3BO30.01g，加100ml加蒸馏水,煮沸呈糊状，然后置温箱内保温保湿备用。 • 小麦称取蔗糖10g、琼脂3.5g、H3BO30.02g,加蒸馏水100ml,加热融化后置温箱内保温保湿备用。 • 棉花称取蔗糖25g、MnSO40.07g、Ca(NO3)20.04g、H3BO30.04g,加蒸馏水100ml,加热融化后置温箱内保温保湿备用。以上培养基pH5.2—6.0。

3、花粉发芽鉴定 • （2）置床发芽 • 将配制好的培养基，乘未凝结时均匀地在载玻片上涂一薄层，制成发芽床。置室温（27—29℃）下5分钟后，用毛笔蘸取刚开花的花粉，轻轻地将花粉弹落在床上，密度要稀而均匀，使花粉发芽力保持正常均一，也便于观察统计。

3、花粉发芽鉴定 • （3）镜检观察 • 　　　花粉置发芽床后，把载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，加盖，水稻在27—29℃下保温保湿5分钟，小麦于22—26℃下1—2小时，棉花于30—32℃下培养2—3小时，然后镜检观察，凡花粉管伸长超过花粉粒直径的即为发芽的花粉，统计花粉发芽率。

4、观察花粉在柱头上的萌发 • （1）棉蓝染色法 • 水稻、小麦取授粉后一定时间（水稻授粉后10—30分钟、小麦授粉后2—4小时）的整个雌蕊，放在载玻片上，滴几滴棉蓝溶液（按乳酸：苯酚：甘油：蒸馏水：棉蓝为25：25：25：25：0。8配制），盖上盖玻片，在盖玻片上一侧滴入40%甘油，在另一侧用滤纸将染料吸去，如此重复进行，直至盖玻片下部为甘油所浸透，然后置显微镜下观察，花粉管为蓝色，而柱头组织无色或淡蓝色。注意染色时间不宜过长。

4、观察花粉在柱头上的萌发 • （1）棉蓝染色法 • 棉花授粉后4—6小时，用刀片切取整个花柱，置于70℃水浴中10—15分钟，取出，纵剖成两半，室温下用0.1%棉蓝溶液染色3—4小时，用乳酚透明过夜，并用新鲜乳酚封固，次日压片观察花粉管伸长情况。

4、观察花粉在柱头上的萌发 • （2）荧光显微镜观察 • 固定取水稻开花授粉后10—15分钟、小麦2—4小时的整个雌蕊，棉花授粉后4—6小时的整个花柱，用卡诺固定液固定，2小时后移入70%酒精中保存备用。

4、观察花粉在柱头上的萌发 • （2）荧光显微镜观察 • 软化制片前，水稻、小麦的材料用8N NaOH软化10分钟（煮沸）。棉花的用10N NaOH软化10小时，然后水洗去碱。 • 镜检将染色的材料置于载玻片上，盖上盖玻片，压片后置荧光显微镜下观察。以BG12为激发光源（蓝紫光）和0515为激光滤片。在此光源下，花粉粒呈暗红色，花粉管呈淡黄色荧光，组织背景黑色。

四、作业 • 1、不同的方法测定花粉生活力，并对测定结果作出分析。 • 2、察荧光显微制片，比较不同作物花粉管伸长情况。

一、目的 学习和初步掌握稻、麦或棉的花粉生活力测定方法。