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因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製

Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope ( UV-VIS ) 雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡 簡易使用流程 ( modified by Dr. Chien). 因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製 TEL : 02-2808-1452 / E-mail : confocal@major.com.tw

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因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製

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Presentation Transcript

  1. Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope ( UV-VIS )雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡簡易使用流程(modified by Dr. Chien) 因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製 TEL : 02-2808-1452 / E-mail : confocal@major.com.tw 緊急聯絡 : 0933-267 613 ( 24 hours on-call )

  2. 系統簡介 : 共軛焦掃描器 ( 請參考光路圖 ) 螢光燈源_汞燈 Ar/Kr雷射調整旋鈕 螢光濾鏡轉盤 穿透光燈源 鹵素燈 雷射電源開關 供電電源開關 防震桌 影像掃描擷取操控旋鈕 ( Control Panel ) 可見光雷射系統 及 電路控制系統 UV 雷射 : 另有獨立的供電開關 反射 / 螢光 及 穿透光光源 的切換開關 顯微鏡總電源開關

  3. 分光菱鏡 掃描器冷卻裝置 分光鏡 螢光感測用 PMT ( 依組配有 1 – 4 個 Channel ) 鏡頭瞳孔照明 之光徑調控鏡 UV 光針孔鏡 Pinhole lens 多光子 螢光影像 感測用的 附加光電 倍增管 PMT K-Scanner 穿透光影像感測 PMT ( Phase contrast, DIC ) Z-軸掃描

  4. Step 1 開機流程 : 可見光雷射 系統電源 UV 雷射電源 • 開機注意事項 : • 確定電源為 AC220 V. • 確定冷氣空調開啟.

  5. Step 2 打開顯微鏡燈源 1. 螢光用汞燈 2. 穿透光用鹵素燈 開機流程 : 2. 按右邊的顯微鏡總電源開關 ( 左邊為 上下 鹵素燈源的切換開關 / Halogen 12V / 100W ) • 按下汞燈開關 • 置於桌下 / Hg 50 W – • * 汞燈開關使用間距至少須達 30 分鐘以上 • * 汞燈使用壽命一般為 100 小時, 然而, 必須視實際燈管效益而定. • 更換時, 請由專人更換調整. 未經許可, 勿擅自動手.

  6. Step 3 開啟共軛焦供電系統 開機流程 : 請依序 1 – 7 按序開機 6 5 4 • Scanner_掃描器電源 • 電腦電源 • Ar 雷射電源 • He-Ne 雷射 ( Red ) • 電源 • ( 鑰匙往右扳下 ) • He-Ne 雷射 ( Yellow ) • 電源 • ( 鑰匙往右扳下 ) • 啟動 Ar 雷射,鑰匙 • 往右扳至 Start • 位置, 再往左扳回 • 至中點位置 首先按下 Scanner 鈕, 開啟掃描器 電源 7 3 1 2 • UV Laser 351 nm/ 364nm(* UV laser 請由專人開啟)  • Ar Laser 458 nm / 488 nm • He-Ne Laser 543 nm  • He-Ne Laser 633 nm 7. 啟動 Ar 雷射, 調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置

  7. 檢視樣品 Step 2 : 光路控制拉桿推入 VIS 位置, 用眼晶觀察樣品 Step 3 : 選用適當的螢光濾鏡 “ 2 ” = I2 ( FITC ) “ 3 “ = N2.( Rodamine ) Step 1 : 調焦 使用電控升降載物檯, 將樣品 移至近焦距處, 用微調旋轉鈕 調焦. 使用浸漬油時, 不能有氣泡產生. Step 4 : 將 Tube lens 轉到 UV-Scan 的位置 Step 5 : 聚焦後, 將汞燈柵門關掉, 避免汞燈過度曝晒樣品, 造成螢光漂白

  8. 啟動軟體 電腦啟動後, 螢幕會顯示告知, 按下 [ Ctrl _ Alt _ Del ] 然後, 不用輸入 Password, 即進入 Windows NT 系統 如果有設密碼 : User : [administrator] / Password : [admin] 啟動軟體 ( 以滑鼠點選, 按二下 ) 電腦會自動起始化 掃描過程中, 請勿觸碰顯微鏡 及 防震桌 !

  9. Start dialog 選取 由於系統啟動後, 掃描器會自動校準, 顯微鏡的 Z-掃描台會自動歸零, 而焦距有所位移. 所以, 有時, 必須再看一下顯微鏡下的樣品, 是否有在聚焦位置 ?

  10. A. 顯微鏡觀察及調焦 B. 選用螢光感測光譜設定 … [ Acquire ] … [ Beam ] C. 設定基本掃描參數 .. [ Obj ] .. [ Mode ] .. [ Format ] .. [ Speed ] D. 設定 Panel Box 的調控參數 與 配置位置 E. 依序執行影像擷取功能 Continuous scan ( 連續掃描 _ 取得最佳調控 ) Single scan ( 單一 2D 影像擷取 ) Series scan ( 連續斷層 3D 影像擷取 ) F. 儲存結果 與 進階影像處理, 量測, 編輯, 輸出列印.

  11. 啟動軟體之前的注意事項 : 如果已完成一般顯微鏡的鏡檢及聚焦, 請依序執下列操作 : 6. 轉至 UV-Scanner 位置 ( 如有 UV-laser 裝置 ) 4. 往外拉至 TCS 1. 先開 Scanner 2. 再開 PC 5. 轉至 “ 4 ” Scanner 的位置 3. 開啟雷射電源, Ar 雷射調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置 * UV laser 請由專人開啟

  12. 注意 : 請留意每一個小 [ 圖示區 ] 的位置, 因為底下的控制版面是 可更改設定與移動的. 所以, 使用人員必須先行清楚每一 圖示區的放置位置. ( 未經允許, 請勿擅自更改圖示區的配置 ) 圖示區 : Control Button ( 可編輯, 可認意組配安置 ….. 您現在使用中的圖示區安排可能與本圖示配置不同 )

  13. Control Panel 的位置與參數設定 檔案管理 ( 存取 ) Control Panel 有 7 個對應位置, 針對每一個 對應位置, 設定所要使用的控置參數 以滑鼠按一下, 即可得到參數選單. PMT Gain 1/2/3/4 Z-focus Zoom Pinhole

  14. 選取 [ Acquire ].. [ Beam ] L : 代表原廠設定 無法變更設定 U : 代表使用者設定 可變更設定 選取應用設定 設定光路及螢光感測光譜範圍 如果要自行設定條件及一個專屬應用檔名 則, 僅按 SAVE 後, 輸入檔明即可.

  15. Glow, Glow (Over)訊號感測超過閥值, 會警示與變藍色 Glow (Under), Glow (Over &Under) Active 參數設定 如果應用為 綠色 及 紅色 兩種顯色 光路徑 分光鏡 可見光雷射調控 ( AOTF ) 選用雷射波長 調整雷射強度 螢光釋放波長 雷射激發波長 光譜範圍調整 可自行調整光譜範圍 或 選用 PMT. 穿透光影像 感測用 PMT Active 表示選用螢光 感測 PMT 選取 Glow ( O )

  16. 基本掃描參數設定 在完成 [ Acquire ] – [ Beam ] 設定後 : 選取 單向掃描 ( Unidirection ) 如果按下滑鼠, 則為雙向掃描 5.選 Airy 1 1. 選取 XYZ 掃描模式 4.選取 400 Medium 3. 選 512 x 512 7. 選取 8 bits 6. Zoom 選取 1 2. 選取所使用中的物鏡 如 PL-APO 63x / 1.32 Oil 完成上列基本設定後, 即可開始執行連續掃描 ( Continuous scan )

  17. 連續掃描 ( Continuous scan ) 移動掃描中的影像 快速調整 PMT 感測 的 gain, 以藍色顯示 出現一點點為最佳狀態 此位置應設為 “ Z “ 軸調控. 存取個人 Panel-Box 設定 調整聚焦, 讓影像清析 小小技巧 : 除了 PMT 及 Z-focus 調整外, 也可調整雷射強度, 光譜感測範圍, 或 Pinhole 大小, 或改變 PMT 的 Offset. 如果, 在經過上列的基本調整後, 已可取得不錯的影像, 則可再按一下 [ Continuous ] scan , 即可取得影像, 供儲存. 如果, 影像仍然有雜訊或不夠銳比, 則可考慮再使用平均 ( average ) 的擷取處理. Averaging 1 – 64 範圍, 可供選取使用, 供影像擷取的平均化, 以消除雜訊 ( 但, 易光漂白的染劑不適用此法 )

  18. 影像調控 顯示視窗 如果應用為 3-ch. ( FITC / TRITC / Cy5) 則第 4 個 ch. 顯示區 為 3-ch Overlay 所用 ch1 ch2 調控參數即時顯示 1 按一下滑鼠右鍵, 可更改顯示顏色 Overlay 此為 Index color 即是, 依照所選定 的顏色來作套色 ch3 ch4 如果是取得 series 影像, 可利用此鈕, 播放連續動態影像

  19. Mode 功能解說 xyz An image stack is recorded from xy-sections in z-direction. ( 最為常用的掃描模式 ) xzy An image stack is recorded from xz-sections in y-direction. xt A line is recorded several successive times. xyt An xy-section is recorded several successive times. xzt An xz-section is recorded several successive times. xyzt An image stack is recorded from xy-sections in z-direction several successive times. xyl An xy-section is recorded at different wavelengths. ( 波長掃描 ) xzl An xz-section is recorded at different wavelengths. Mode : 影像擷取掃描模式

  20. Single Scan / 單一影像擷取 選取 ( 可配合 Line average或 Averaging _ Frame by Frame )

  21. 3D series / 連續斷層影像擷取 決定光切數目 可配合 Averaging 以消除雜訊 每一切片的影像要 做平均處理嗎 ? 1. 連續掃描時, 調 Z-焦距, 找出最上點, 在 Begin按一下, 2. 再找出最下點, 然後在 End按一下. 3. 最後又於 連續掃描框內 ( continuous )按一下. 4. 再選切片數目, 平均數目, 按 Series 光切掃描.

  22. The Image Tool Window Tool selection Dialog of the current Tool Operation Buttons Preview

  23. [ 3D ] .. [ ImageTool ] Projection & Animation 設定參考 Rotation Rotation Preview 快速預覽 Scaling the z-Axis Animation

  24. Usage (IV) The Operation Buttons Prev: Compute the result and show it in the Preview Window Apply:Compute the result and transfer it into the Experiment Close: Close the Image Tool Window

  25. Projection & Animation Projection & Animation Tool Source Parameter division Current parameter

  26. Projection & Animation Maximum projection Average projection Transparent projection Transparent projection (inverted z-Direction)

  27. Projection & Animation Rotation z-Axis x-Axis y-Axis Original z-Rot. = 25 y-Rot. = 120 x-Rot. = 120

  28. Projection & Animation Stereo View

  29. Projection & Animation Stereo Effect Near Object Far Object Stereo Eye Angle

  30. Projection & Animation Stereo Effect Images for the left and the right eye Stereo Image

  31. 範例 : 單一螢光影像擷取 ( FITC ) • 玻片 : 0.17 mm • 浸漬油 : r =1.5180 • Beam : L : FITC • Laser : AOTF 調控約至 70% 處 • Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil • Mode : XYZ • Format : 512 x 512 • Speed : 400 ( medium ) • Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 ) • Zoom : 1 ( 原廠起始設定 ) • Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 ) • Average : 8 ( 原廠起始設定 ) • PMT 1 gain : 約為 700 左右 • 顯示 : Glow ( O ) • Overlay 顯示 : RGB • Continuous scan : 取得所欲觀察的聚焦面 • 再按一次 Continuous : 停止掃描 • 如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔. • 如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影像作為平均取像 ) • 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像.

  32. 範例 : 雙重螢光影像擷取 ( FITC / TRITC) FITC • 玻片 : 0.17 mm • 浸漬油 : r =1.5180 • Beam : L : FITC / TRITC • Laser : AOTF 調控約至 70% 處 • Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil • Mode : XYZ • Format : 512 x 512 • Speed : 400 ( medium ) • Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 ) • Zoom : 1 ( 原廠起始設定 ) • Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 ) • Average : 8 ( 原廠起始設定 ) • PMT 1 / 2 gain : 約為 700 左右 • 顯示 : Glow ( O ) • Overlay 顯示 : RGB • Continuous scan • 再按一次 Continuous : 停止掃描 • 如果影像品質及解析可被接受, 請存此影像檔 ( save as ..) • 如果訊號太弱, 或有雜訊, 請執行 Average ( 如取 12 張影像作為平均取像 ) • 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像. TRITC

  33. Timelapse ( T ) / 長時間掃描記錄 在 Mode 選用有 “ T “ 功能的掃描模式才可執行此功能

  34. Line-Mode „xt“ Frame-Mode „xyt“ Stack-Mode „xyzt“ Time-Series 1/4

  35. Line-Mode „xt“ Configuration Time-Series 2/4

  36. Stack-Mode „xyt“ Configuration Time-Series 3/4

  37. Stack-Mode „xyzt“ Configuration Time-Series 4/4

  38. 關機流程 : 請依序 1 – 7 按序關機 4 3 2 6. 結束軟體 首先按下 Scanner 鈕, 開啟掃描器 電源 1 8 5 7 注意 : 當雷射冷卻至少 15 分鐘後 再關掉 [ 8 ] 位置的電源 ( 風扇 ) 1. 關掉 Ar 雷射, 往左調整 旋鈕轉到原點最小處. 關掉顯微鏡燈源 ( 汞燈, 鹵素燈 ), 擦鏡頭, 關掉實驗室總開關

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