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真菌常用的体外药敏试验方法比较

真菌常用的体外药敏试验方法比较. 真菌药敏试验临床难以开展的原因. 1.按照 NCCLS 推荐的稀释法,操作繁琐 2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定 3.纸片法试验未得到 NCCLS 认可 4. E 试验价钱太贵 5.药敏孵育时间因菌种而不同. 体外敏感试验与临床治疗相关性. 真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性好 对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临床治疗的相关性还有待进一步证实

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真菌常用的体外药敏试验方法比较

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Presentation Transcript

  1. 真菌常用的体外药敏试验方法比较

  2. 真菌药敏试验临床难以开展的原因 1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐 2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定 3.纸片法试验未得到NCCLS 认可 4.E试验价钱太贵 5.药敏孵育时间因菌种而不同

  3. 体外敏感试验与临床治疗相关性 • 真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性好 • 对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临床治疗的相关性还有待进一步证实 • 体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的动力学和复杂的生物学作用

  4. 真菌体外药物敏感试验方法 • NCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法 • E-test法 • NCCLS M44-P纸片扩散法 (仅限氟康唑) • 丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可)

  5. 真菌体外药敏用培养基 • 常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备： RPMI 10.4g MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸） 34.53 g 蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25℃）， 用蒸馏水溶至1000ml， 高压灭菌后，冷却至50 ℃ 加入RPMI1640用0.22µm滤膜抽滤除菌，4℃保存。

  6. 真菌体外药敏用培养基 • E-test法 ： 在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。 • NCCLS纸片扩散法 ： Mueller-Hinton 琼脂 补充2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝 • 丹麦ROSCO纸片扩散法 ： 改良的SHADOMY（ PH7.0）培养基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。

  7. 菌液制备 将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。 常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍 接种浓度约为0.5~2.5×103CFU/ml 微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍 接种浓度约为1～5×103CFU/ml E-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。 Rosco纸片扩散法： 1. 念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀(1~5×105CFU/ml) 2. 隐球菌属： 1.0麦氏浊度 3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释

  8. 常量肉汤法(M27-A) • 先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀释，使其起始浓度为640µg/ml, 终末浓度为1.25µg/ml，分装无菌洁净的12mm×75mm试管： － 64 32 16 8 4 2 1 0.5 .25 .125 ＋ 前10管： 0.2ml氟康唑＋1.8ml菌液 念珠菌属 35℃孵育48小时 新型隐球菌 72小时 读取MIC结果 2ml菌液 1.8ml1640

  9. 常量稀释法药敏结果判定 • 氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制 • 其他唑类药物为80%抑制 （取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓度） • 质控株 克柔念珠菌ATCC 6258 近平滑念珠菌ATCC 22019 白念珠菌ATCC 90028 白念珠菌ATCC 24433

  10. 微量肉汤法 • 氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2×常量法的浓度（即128µg/ml ），终浓度为0.25µg/ml 。 氟康唑：1-10孔分别为 100ul 菌悬液：1-10孔分别为 100ul 。37℃ 。37℃ 64 32 16 8 4 2 1 .5 .25 .125 ＋ － 35 ℃ 新型隐球菌72小时 ， 其余菌株 48小时读取MIC结果 200ul菌悬液 200ulRPMI汤

  11. 酵母菌的NCCLS M27-A各药物折点 粘膜及系统性感染： • 氟康唑（除克柔念珠菌） 敏感： ≤ 8µg/ml • 中介： － • 耐药： ≥64µg/ml 粘膜感染： • 伊曲康唑 敏感： ≤0.125µg/ml • 中介： － • 耐药： ≥1µg/ml 粘膜及系统性感染： • 5-氟嘧啶 敏感： ≤4µg/ml • 中介： 8~16µg/ml • 耐药： ≥32µg/ml

  12. 酵母菌E-test法 瑞典AB Biodisk 优点：有较好的重复性和稳定性 MIC

  13. E-test法 0.5麦氏比浊液 （约为1~5×106CFU/ml）。 菌悬液均匀涂布于药敏板上 35 ℃培养24小时读取结果 光滑念珠菌 新型隐球菌 等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。

  14. E-test法评价 • 准确性高,且操作简便 • E-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS推荐的常量肉汤稀释法测得的MIC • 20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真实反映药物对致病菌的敏感性 缺点：1.价格太高 每片40-50元 2. 吡咯类MIC终点不好确定

  15. 酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003 • 培养基： Mueller-Hinton琼脂 • 补充 2％ Glucose • 0.5ug/ml Methylene blue dye • PH7.2-7.4 • 优点：有较好的重复性和稳定性 • 操作简便，价廉 • 缺点：目前只限氟康唑

  16. NCCLS纸片扩散法 • 0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。 菌悬液均匀涂布于药敏板上 • 步骤同细菌敏感试验操作一致， • 35～37℃孵育18～24小时， • 对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至1麦氏单位，孵育48小时， • 光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环直径。

  17. 酵母菌纸片扩散法敏感试验NCCLS M44-P. 2003 氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度 S＝Susceptible SDD=Susceptible－Dose Dependent R=Resistant

  18. 酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P. 2003 氟康唑对标准菌株 24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围 标准菌株 氟康唑25ug 沃尔康唑1ug 白念珠菌 ATCC90028 28-39 31-42 近平滑念珠菌 ATCC22019 22-33 28-37 热带念珠菌 ATCC750 26-37 － 克柔念珠菌 ATCC6258 － 16-25

  19. ROSCO纸片扩散法 ROSCO纸片扩散法： 1. 克柔念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀释 菌液为5×105CFU/ml 2. 隐球菌属： 1 麦氏浊度 3. 其它酵母菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释 菌液为2.5×106CFU/ml • 将稀释好的菌液涂布在改良的SHADOMY（ PH7.0）培养基上 • 其它操作同细菌。

  20. Rosco纸片扩散法药敏结果判定 • 读取抑菌环直径近似到mm • 在大约80%抑制区为测量边界 • 在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落， <15可忽略不计

  21. Rosco纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 改良SHADOMY琼脂，PH7.0 试验药品及剂量 AMB 10µg，IT 8µg， FLA 15µg，FC 1，10µg， FC 10µg ，KET15µg等 接种的菌量： 5×105CFU/ml （克柔念珠菌先制成 0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10 。 隐球菌属配1.0麦氏不稀释）其它菌种配0.5麦氏浊度， 1：1稀释 培养条件 念珠菌属35℃培养18~24小时， 新型隐球菌30℃培养42~48小时 结果判读 FC及AMB100%被抑制 唑类药物80%抑制 质控株 光滑念珠菌2238NL 白念珠菌ATCC64548 白念珠菌ATCC64550 NCCLS纸片扩散法 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属 培养基 Mueller-Hinton 琼脂中补充2% 的 葡萄糖和0.5μg/ml的美蓝 试验药品及剂量 FLA 25µg 接种的菌量 1 ～5×106/mL 隐球菌 1.0麦氏浊度 培养条件 35℃孵育18～24小时 新型隐球菌培养42~48小时 结果判读 FC及AMB100%被抑制， 唑类药物80%抑制 质控株 白念珠菌ATCC90028 近平滑念珠菌ATCC22019 两种纸片扩散法的比较

  22. 粘膜酵母菌感染 氟康唑 ，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug ，特比奈吩，咪康唑等 敏感：≥20mm 中介 ：12~19mm 耐药：≤11mm 两性霉素B， 制霉菌素 伊曲康唑 敏感：≥15mm 中介：10~14mm 耐药：无抑菌环 氟胞嘧啶10ug 敏感： ≥30mm 用于黑曲霉 中介：23~29mm 耐药：≤22mm 灰黄霉素 敏感：≥10mm 中介：－ 耐药：无抑菌环 Rosco纸片扩散法各药物折点

  23. 系统性酵母菌感染 氟康唑15ug 18-24h 敏感：≥30mm ≤4 中介：29~23mm 8-16 耐药：≤22mm ≥32 伊曲康唑 8ug 18-24h 敏感：≥20mm ≤0.06 中介：19~12mm 0.125 耐药：≤11mm ≥0.25 这个MIC标准为纸片法的相应值 Rosco纸片扩散法各药物折点

  24. 系统性酵母菌感染 酮康唑 15ug 纸片和培养基广州乐通公司可供应 敏感：≥30mm ≤0.12 中介：23-29 0.25 耐药： ≤ 22mm ≥ 0.5 两性霉素 10ug 敏感：≥15mm ≤1 中介：14-10 2 耐药： ≤ 9mm ≥ 4 氟胞嘧啶1ug 敏感：≥20mm ≤4 中介：12-19 8-16 耐药： ≤ 11mm ≥ 32 氟胞嘧啶10ug 用于黑曲霉 敏感：≥30mm ≤4 中介：23-29 8-16 耐药： ≤ 22mm ≥ 32 Rosco纸片扩散法各药物折点

  25. 两性霉素B 克霉唑- 特比奈酚

  26. 结论 • 1.常量稀释法难以推广 • 2.微量板浪费 • 3.NCCLS纸片法只做氟康唑 • 4.建议目前用Rosco纸片 • 5.寄希望将来推行Etest 法

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