项目五葡萄的组织培养与快繁技术

项目五葡萄的组织培养与快繁技术

教学目标 • 能利用葡萄休眠枝条进行催芽和诱导再生 • 能对不定芽进行壮苗和生根培养 • 能进行葡萄组培苗的炼苗和移栽 • 能解决葡萄组培中遇到的常见问题 • 了解葡萄脱毒的方法

项目介绍 • 葡萄为葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis）落叶木质藤本浆果果树。葡萄科共有14个属968种植物，葡萄属植物中具有经济价值的约20余种。 • 成熟浆果中含有15%—25%的葡萄糖和果糖以及多种对人体有益的矿物质和维生素。

葡萄为多年生果树，以嫁接、扦插等无性方式繁殖，但长期无性繁殖导致多种病毒的积累。葡萄为多年生果树，以嫁接、扦插等无性方式繁殖，但长期无性繁殖导致多种病毒的积累。 • 在葡萄上已鉴定的病毒已达55种以上，其中以扇叶病、卷叶病、茎痘病和栓皮病的发生最为广泛。

工作任务 • 选取优良葡萄品种植株的顶梢为外植体材料 • 表面消毒后，在超净工作台上剥离茎尖进行微茎尖培养 • 成苗后进行病毒检测，无病毒的植株即为葡萄脱毒试管苗 • 将脱毒试管苗繁殖成种苗 • 取脱毒试管苗或脱毒种苗的器官进行芽诱导培养 • 形成的小苗进行壮苗、生根培养后，进行驯化移栽

微茎尖培养脱毒 优良品种病毒检测壮苗、生根苗圃育苗炼苗、移栽芽诱导葡萄脱毒苗品种种苗获得葡萄脱毒苗的流程图

实践知识 （一）外植体的选择 • 茎尖、茎段、腋芽、叶片、叶柄、根尖、花粉、花药、胚、胚珠、胚乳、子房等 • 整个器官、部分组织 • 单个细胞、原生质体一、葡萄组培快繁技术外植体必须使用无菌材料

以茎段、茎尖为外植体时 • 应选择品种特性优良、生长健壮、无病虫害的休眠枝条，用0.01%的6-BA溶液浸泡24h，打破休眠，然后扦插到盛有无菌基质的苗床上，置于洁净的室内或培养箱中促使其萌发，温度控制在25-28℃. • 若生长季节于田间取材，则要在晴天、无露珠时进行，然后将材料插入培养液或自来水中，置于室内或培养箱中进行预培养。

（二）芽的培养与诱导再生 1. 取材与消毒 • 当催芽处理的材料长出新梢10-15cm时，取4-5cm的嫩梢，自来水冲洗15-30min，然后剪取1cm的茎尖。 • 除去幼叶后置于无菌条件下消毒；先用2%次氯酸钠溶液浸泡消毒3-5min，用无菌水冲洗3-5次，再用0.1%升汞溶液浸泡5-10min，用无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸净材料上的水分，备用。

2. 接种和培养 • 无菌条件下，将芽放在解剖镜下用锋利的解剖刀切取0.5-1cm的茎尖，接种于事先准备好的诱导培养基上进行培养。 • 培养温度为25±2 ℃。接种1-2周暗培养，2周后光照（12-16h/d/，1000-3000Lx）培养，15d后可见到不定芽长出。

（三）壮苗、生根与移栽 1. 壮苗与生根培养 • 当不定芽长至2-3cm以上时，为了获得大量健壮的试管苗，就要从生长缓慢的诱导分化培养基中，将不定芽转接到生长快得壮苗生根培养基中培养方法是无菌条件下将试管苗剪成带叶单芽段接入壮苗生根培养基中培养

2. 炼苗与移栽 • 葡萄组培苗的驯化移栽多在春季或冬季的温室大棚中进行。（1）光培炼苗（2）沙培炼苗（3）温室营养钵炼苗及大棚移栽

（1）光培炼苗 • 当组培苗根长2-3cm、具有3-4片正常叶片时，转入温室或大棚内，开瓶在20000-40000Lx的自然光下炼苗3-7d，待叶片油亮、幼茎呈淡红色时，即可将生长势强、根系粗壮的试管苗从培养瓶中取出。

（2）沙培炼苗 • 清晨或傍晚，组培苗出瓶，栽入沙床，株距3-4cm，行距8-10cm。栽后沙床加盖小拱棚。最初3d的棚内温度保持在（25±2）℃，最高不超过30 ℃，最低不低于20 ℃，相对湿度保持在80-95%，光强逐渐增强到40000Lx。6-7d拆除拱棚。

（3）温室营养钵炼苗及大棚移栽 • 经沙培后的合格苗，在空气湿度不低于70%、温度20-25 ℃、散射光的条件下，栽入装有营养土:沙:腐熟有机肥=1:1:0.2的营养钵中炼苗。待新叶长出后再定植到大田苗圃中。

二、葡萄脱毒技术 葡萄感染的病毒主要有卷叶病毒、栓皮病毒、扇叶病毒、黄脉病毒和斑点病毒等

葡萄卷叶病 特征是先从基部叶片开始，叶缘向下反卷，并逐渐向其他叶子扩展。反卷后的叶片变厚变脆，叶脉间出现坏死斑或叶片干枯，叶片在秋季正常变红时间之前就开始变成淡红色。随着秋季深入，病叶变成暗红色，仅叶脉仍为绿色。

葡萄栓皮病 • 由一种潜隐性病毒侵染而引起。表皮粗糙而纵裂，嫁接苗木接口上下木质部出现不规则的沟槽和凸凹病状。树势逐年衰弱，生长阻滞，几年之后接穗部死亡。 • 初夏前后，叶片上逐渐变黄，红色品种叶片由黄色变成紫红色，黄白色品种叶片由黄色变成黄褐色，叶缘向背面反卷。

1.茎尖培养法 • 将感染病毒的植株在5℃下冷藏保存，以后再温度25℃、相对湿度80%、每日16h光照的条件下水培，长出的新芽剥离切取带1~3个叶原基0.2~0.3mm茎尖进行离体培养，即可获得脱毒苗。

2.热处理脱毒 • Ⅰ将葡萄无性系处理材料置于38℃，CO21200mg/L的人工气候箱中，经30min处理，较易从枝条顶端或休眠芽中出去扇叶病毒。其他病毒较难消除。 • Ⅱ直接将葡萄嫩茎浸泡在50℃温水中处理10~20min，可治疗皮尔斯病。

3.热处理结合茎尖培养 • 对盆栽葡萄苗先进行热处理，再剥取茎尖培养。或者剥取茎尖后，接种于培养基，进行高温培养。

问题探究 • 一、影响葡萄外植体成活、分化的因素 1、影响葡萄外植体存活的因素 2、影响葡萄外植体诱导分化的因素

二、褐变现象与玻璃化现象的原因及解决措施 • 1.褐变的含义

（2）褐变的影响因素 • 植物的种类和品种 • 生理状态 • 处于幼龄期的植物材料较从成年植株采集的植物材料褐化程度轻，老熟组织较幼嫩组织褐化程度严重。 • 处于生长季节的植物体内含有较多的酚类化合物，所以夏季时取材能容易发生褐化，冬春季节取材则材料褐化死亡率最低

培养基成分 无机盐浓度过高会使某些观赏植物的褐化程度增加 • 培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使更多酚氧化酶的活性提高，从而加速培养材料的褐化程度。、 • 其他原因

解决措施 • 选择适宜的外植体及培养基 • 连续转移 • 加抗氧化剂 • 加活性炭

2.玻璃化的原因及防治解决措施 • 玻璃化的含义

玻璃化的症状表现 • 试管苗矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气孔，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明。 • 叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易碎 • 组织发育不全或畸形，体内含水量高，干物质等含量少 • 试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成活率极低，因而繁殖系数低。

引起试管苗玻璃化的原因 • 激素浓度 • 琼脂用量 • 温光条件 • 通风状况 • 培养基成分 • 植物材料

玻璃化的防治解决措施 • 适当控制培养基中屋脊营养成分 • 提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度 • 适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 • 增加自然光照 • 控制好温度 • 改善培养器皿的气体交换状况 • 在培养基中添加其他物质

项目五 葡萄的组织培养与快繁技术