Геномика

1. Геномика

2. Очень полезная книга для всех, кто интересуется геномикой и ее разнообразными применениями в медицине

3. Геномика – раздел генетики, посвященный изучению целых геномов живых организмов. • Геном – полная совокупность генетического материала в гаплоидном наборе. • Обычно выделяют ядерный, органелльный (пластидный или митохондриальный), плазмидный (у бактерий) геномы.

4. ГЕНОМИКА • ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ • 1. «Обратная генетика» (анализ фенотипов мутантов). • 2. Экспрессия генов: • - гибридизация нуклеиновых кислот; • - репортерные конструкции; • - взаимодействие белков. • 3. Координация экспрессии генов • метод микрочипов (microarray-анализ); • РНК-интерференция. • СТРУКТУРНАЯ • 1. Нуклеотидная последовательность генома. • 2. Состав генома. • 3. Структура генов: • домены; • регуляторные элементы; • семейства генов (паралоги). • 4. Компьютерный анализ белков – эволюционная геномика.

5. Геномика имеет огромное как теоретическое, так и прикладное значение для селекции, биотехнологии, фармакологии и других областей. Но особенно большое применение она находит в медицине.

6. СТРУКТУРНАЯ ГЕНОМИКА

7. Размеры геномов разных организмов

8. ГЕНОМЫ БАКТЕРИЙ К 2003 г. определена полная нуклеотидная последовательность геномов более 60 видов и штаммов бактерий и археобактерий (включая стафилококк, псевдомонаду, метанококк и др.)

9. Геномы эукариот

10. У бактерий на один ген приходиться примерно одна 1000 п.н., и гены в хромосоме упакованы плотно, межгенные промежутки по длине незначительны.У высших эукариот, помимо того, что значительная часть ДНК занята различными повторяющимися последовательностями, межгенные пространства значительны (тысячи п.н.), а в самих генах основная часть ДНК приходиться на долю интронов. Так первичный транскрипт гена миодистрофина человека имеет длину около 2,5 м.н.п. Из них в зрелой мРНК остается только 14 т.п.н. (0,6%), остальная РНК приходится на интроны.

11. Эукариотическая ДНК

12. Ортологичные гены– гомологичные гены в геномах разных организмов, происходящие от общего предкового гена. Паралогичные гены– гомологичные гены внутри одного генома: дупликация, дивергенция → семейство генов; увеличивают белковый репертуар; новые функции; адаптивность; усложнение организации клетки.

13. Проекты по секвенированию геномов • Штаммы более 40 видов бактерий • Протисты (тетрахимена) • Растения (ячмень, табак, сосна) • Тутовый шелкопряд, пчела • Шпорцевая лягушка • Курица • Собака, кошка • Кенгуру • Шимпанзе

14. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА

15. Среди различных подходов в функциональной геномики рассмотрим два метода, которые позволяют одновременно анализировать экспрессию всех или хотя бы большинства генов в геноме. Речь пойдет о ДНК-микроэррей и РНК-интерференции.

16. Microarray-анализ • ДНК-микрочипы позволяют одновременно анализировать информацию об экспрессии многих тысяч генов. • Основными типами ДНК-микрочипов являются кДНК-микрочипы или синтетические олигонуклеотидные чипы.

17. Что можно изучать с использованием ДНК-микрочипов? • экспрессию генов в различных тканях • изменение экспрессии генов с течением времени как результат внешнего воздействия (взаимодействие клетки с патогеном, лекарством). • экспрессию генов в норме и при патологии: в нормальных и мутантных клетках, в нормальных и раковых клетках. Если с помощью микроэррей-анализа сравнить экспрессию генов в опухолевой и нормальной тканях, то можно выявить гены, которые специфически экспрессируются в опухоли. • Также можно выявлять экспрессию генов, специфическую для определенного заболевания. Каждое заболеванние может иметь собственный профиль экспрессии – так называемый штрих-код.

20. Технология микроэррей-анализа • Получение организмов с альтенативными характеристиками • Получение образцов РНК, и затем кДНК • Мечение образцов кДНК флуоресцентными красителями • Гибридизация с олигонуклеотидами ДНК, фиксированными на подложке. Каждый олигонуклеотид имеет определенные координаты на подложке • Анализ

21. Сканированный ДНК-чип

22. кДНК микрочипы YELLOW - если ген экспрессируется и в клетках больного (Cy5) и в клетках здорового (Cy3) человека, то в данном пятне будет гибридизоваться ДНК, меченная и красной и зеленой красками, и в результате получится желтый цвет; RED - если ген экспрессируется только в клетках больного (Cy5), то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная красной краской; GREEN - если ген экспрессируется только в здоровых клетках (Cy3), то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная зеленой краской; BLACK – если ген не экспрессируется ни в больных, ни в здоровых клетках.

23. РНК-интерференция (RNA silensing) • РНК-интерференция (RNA silensing) – это подавление экспрессии генов у эукариот (замалчивание генов) на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими РНК (small interfering RNA – siРНК).

24. регуляция экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях Проявления функций малых РНК • разрезание матричной РНК (mРНК) • репрессия трансляции • ремоделирование хроматина

25. История открытия 1995 г.Guo S. and Kempues K.J. Метод антисмысловых РНК В цитоплазму эмбрионов нематоты Caenorhabditis elegansвводили РНК в антисмысловой ориентации к гену par-1. Контроль: РНК в смысловой ориентации (соответствующая мРНК) к тому же гену. Результат: замалчивание гена вызывала и антисмысловая РНК, и смысловая РНК

26. История открытия Эндрю Файер Крэйг Меллоу 1998 г. Fire A. and Mello C. Объект: Caenorhabditis elegans Продемонстрировали: именно двунитевая РНК является непосредственным агентом в подавлении экспрессии генов, которая присутствовала в препаратах с однонитевыми молекулами как примесь. агент, инициирующий замалчивание генов dsRNA (double-strained RNA) Нобелевская премия по физиологии и медицине в 2006 г.

27. Основные свойства РНК-интерференции • Специфичность (подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой dsРНК). • РНК-интерференция реализуется на посттранскрипционном уровне: фрагменты dsРНК, соответствующие последовательностям промотора или интрона не вызывали РНК-интерференцию. • Эффект РНК-интерференции, возникший в каком-либо участке тела С. elegans может распространяться по всему организму и передаваться по наследству потомкам.

28. РНК-интерференциюобнаружили у большинства эукариотических организмов в частности у • простейших • кишечнополостных • насекомых • грибов • растений • млекопитающих

29. Механизм РНК-интерференции Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК-интерференция. 1. Эндонуклеаза Дайсер (Dicer)связывается с dsРНК и разрезает ей на короткие фрагменты в 21-23 п.н. – siРНК (short interfering RNA).

30. Механизм РНК-интерференции Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК-интерференция. 2. siРНКсвязываются с ферментативным комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), который использует одну ее цепь (комплементарную мРНК) для связывания с мРНК.

31. Механизм РНК-интерференции Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК-интерференция. 3. Нуклеазная активность комплекса RISC деградирует мРНК.

32. Caenorhabditis elegans-идеальный объект для генетических исследований • размер 1мм • гермафродит • короткий жизненный цикл (50 часов!) • Известное число клеток (959 клеток) • гаплоидный набор 5 аутосом + Х-хромосома, • геном секвенирован, ~10 млн.п.н., 19427 генов • хранение мутантных особей криогенным способом • Современные методы функциональной геномики • РНК-интерференция • получение делеционных мутантов

33. РНК-интерференция как инструмент функциональной геномики C. elegans Kamath et al. иAshafi et al.(2003)

34. РНК-интерференция как инструмент функциональной геномики C. elegans NATURE 2003 |VOL 421 | Р. 231-237

35. Биологическая роль РНК-интерференции защита от ДНК- и РНК-содержащих вирусов (растения) подавление активности мобильных генетических элементов Посттранскрипционное замолкание генов (PTSG; мишень РНК) контроль развития организма участие в детерминации клеток изменение структуры гетерохроматина (РНК-зависимое метилирование) Транскрипционное замолкание генов (TSG; мишень ДНК)

36. Выводы: • РНК-интерференция - это подавление экспрессии генов у эукариот на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими РНК. • Биологическая роль РНК-интерференции заключается в - антивирусной защите (растения) - контроле перемещения МГЭ - участии в регуляции процессов развития - ремоделировании хроматина - участие в процессе детерминации клеток • Этот процесс является многоэтапным, контролируется набором генов, кодирующих белки семейства Argonaut, Dicer и др. • РНК-интерференция – экспериментальный метод функциональной геномики эукариот и генотерапии.

37. МикроРНК: регуляция экспрессии генов микроРНК (miRNA) Консервативны у отдаленных видов. Одноцепочечные РНК длиной около 22 нуклеотидов. Комплементарно (или частично комплементарно) связываются с мРНК, что приводит к ее разрушению или к ингибированию трансляции.

38. микроРНК: особенности структурной и геномной организации Одинаковая последовательность может кодироваться разными генами. Гены миРНК чаще всего располагаются между полипептид-кодирующими генами. Могут располагаться в интронах полипептид-кодирующих генов. Транскрипция происходит параллельно с транскрипцией пре-мРНК данного гена. Гены миРНК организованны в кластеры, транскрибируемые как мультигенные РНК-продукты.

39. Перспективы использования геномики в практике 1. Создание лекарств нового поколения. Вакцины и иммунофакторы нового типа. 2. Создание новых форм растений и животных, устойчивых к стрессовым факторам. 3. Создание продуцентов для биотехнологии. Идентификация новых «полезных» генов. 4. Применение методов геномики для оценки и мониторинга биоресурсов. 5. Идентификация генов, ответственных запредрасположенность к болезням. Новый уровень диагностики и профилактики. Генотерапия.