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代谢组学

代谢组学. 学生：赵珊 夏常艳 王亮根 李戆敏 2008.10.26. 代谢组学的定义. 代谢组学 ( metabonomics/metabolomics) 是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。代谢组学的中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，联系该变化规律与所发生的生物学事件或过程的本质。 有人认为，“基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。”（ Bill Lasley, UC Davis ）. 研究手段. 分析方法 色谱 - 质谱联仪方法 磁共振波谱法

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代谢组学

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  1. 代谢组学 学生：赵珊 夏常艳 王亮根 李戆敏 2008.10.26

  2. 代谢组学的定义 • 代谢组学( metabonomics/metabolomics) 是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。代谢组学的中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，联系该变化规律与所发生的生物学事件或过程的本质。 • 有人认为，“基因组学和蛋白质组学告诉你什么可能会发生，而代谢组学则告诉你什么确实发生了。”（Bill Lasley, UC Davis）

  3. 研究手段 • 分析方法 • 色谱-质谱联仪方法 • 磁共振波谱法 • 色谱-核磁-质谱联仪法 • 数据分析处理 • 非指导性(unsupervised)方法 主成分分析(principal component analysis，PCA) • 指导性(supervised)方法 偏最小二乘法为基础的分析(partial least square,PLS)

  4. 应用 • 在基础生命科学研究中的应用 代谢组变化的分析可以与基因或表达改变的后果联系起来，从而认识相关基因的功能 动物宿主代谢和体内菌群代谢相关性的整合研究 • 在药物研发中的应用用于 药物筛选、药物毒理、药理和临床评价等诸多方面 • 在病理生理研究中的应用 高血压、多种肿瘤、老年骨质疏松、风湿性关节炎、可传染性脑病、血吸虫病、应激、肠炎和克朗氏病、衰老、肠道综合征、糖尿病和肝炎、先天性代谢疾病等疾病 • 营养代谢组学 表儿茶素影响动物代谢组、大豆异黄酮影响人体代谢组、长链不饱和脂肪酸动物代谢组影响

  5. 基于LCMS和NMR的番茄代谢组学相关性分析 （Intra- and inter-metabolite correlation spectroscopy of tomato metabolomics data obtained by liquid chromatography-mass spectrometry and nuclear magnetic resonance） 作者：Sofia Moco, Jenny Forshed, Ric C. H. De Vos, Raoul J. bino, Jacques Veroort 文献来源：Metabolomics (2008) 4:202–215 DOI 10.1007/s11306-008-0112-8

  6. 前言 • NMR和LCMS是代谢学研究的常用的技术手段。 • 将同一样品的NMR和LCMS谱图分析获取的代谢组学数据统计结合，这就可以了解同一代谢物的光谱及其性质的关系。 • 相关性分析是一种统计学方法，可用于建立一生物系统代谢物信息的相互关系。 • 在本文中， 利用1H NMR和精确质量液相—四极杆飞行时间质谱（LS- QTOF-MS）技术分析50种蕃茄栽培品种成熟果实的代谢谱图。

  7. 材料和方法 • 50个蕃茄栽培品种（94种基因型，华盛顿的温室） • 六种标准品（L-Trp，D-(+)-Glc，柠檬酸，芦丁, 氯原酸, α-蕃茄素） • 样品前处理 蕃茄切片→氮冷冻→-80℃保存→冷冻干燥→精确称取0.3克干粉→加1.2ml甲醇→超声15min→3000g离心5min→φ0.2μm过滤→取600μl,NMR分析→稀释4倍,LCMS分析（4 ℃ 条件下进行）。

  8. NMR分析 500 MHz Bruker AMX NMR 光谱（5mm TXI 探针，298 K） +Bruker XWIN-NMR version 2.1（傅里叶变换） • LCMS分析（LC-QTOF-MS） Waters Alliance 2795系统+分析柱+ HTWaters 2996 PDA 检测器+QTOF Ultima V4.00.00质谱 • 数据处理 软件：MATLAB version7.10 主成分分析（PCA） 相关性分析：Pearson相关性系数 马尔距离：MD＝

  9. 结果与讨论 • 1H NMR分析 • LCMS分析 • 标准品的NMR和LCMS响应值 • 样品LCMS-LCMS信号的相关性 • 生物学样品NMR-LCMS信号的相关性

  10. 1H NMR分析 芳香族化合物区 • 检测方法是建立先前报导的番茄样品研究结果和基于NMR的数据库。 • 初级代谢物：浓度高 • 次级代谢物：种类多 糖区 氨基酸区

  11. LCMS分析 • 代谢谱图与以前报导相似（MOCO et 2006) • 检测方法基于先前出版的番茄代谢组学的LCMS数据库

  12. NMR/LCMS数据的PCA • 樱桃番茄与牛肉番茄和圆番茄的代谢差异较大，牛肉番茄和圆番茄的代谢相似

  13. 标准品的NMR和LCMS剂量效应 • 六种标准品在两种方法的计量效应关系。 • 在NMR中，仪器响应是呈线性关系（所有共振和被测的代谢物，相关性系数均值为1）。 • 新型MS检测范围更广，本实验中，其检测响应在母离子强度达到20000个/扫描时呈线形的

  14. 样品NMR-NMR信号的相关性 • 将取准后的蕃茄样品NMR信号强度进行相关性分析来鉴定品系数据矩阵中有相关的NMR信号。 • 相关系数|r| ≥ 0.8→有相关 • 1008个NMR谱峰， >30000相关（置信区间α＝3.0%） • 理论上不同样品中同一化合物显著相关，如蕃茄样中的葫芦巴碱（A）、蔗糖（B）、柠檬酸（C）证明这点。

  15. 蔗糖在5.385ppm处强特征信号 ；在3-4.5ppm处有重叠（游离糖，糖代谢物）→蔗糖在蕃茄中含量高。 相关性分析（可从一组混杂的信号中分出同一化合物的信号） → 内源代谢物鉴定变得容易 样品中胡芦巴碱信号强度低→其部分质子高度去屏蔽化→其部分共振区间出现空白（如在9.2&8.9ppm）

  16. 样品LCMS-LCMS信号的相关性 • 3374个质谱信号，>130000明显相关（ α＝1.2% ）。 • 同一代谢物中质谱信号中相关度最明显的是蔗糖(r >0.96) 。 • 三个化合物的分析情况：蔗糖(341 m/z)、Phe (164 m/z)和氯原酸(353 m/z, 保留时间14.9 min)。

  17. 氯原酸不但与其特异异构体还和其衍生物高度相关→蕃茄中有一系列的氯原酸衍生物；可鉴定复杂混合物中生物化学高度相关的化合物；显著（r>0.8）的LCMS-LCMS相关不仅在同一代谢物中还在化学相关的代谢物中。氯原酸不但与其特异异构体还和其衍生物高度相关→蕃茄中有一系列的氯原酸衍生物；可鉴定复杂混合物中生物化学高度相关的化合物；显著（r>0.8）的LCMS-LCMS相关不仅在同一代谢物中还在化学相关的代谢物中。 氯原酸 II (353 m/z at 14.9 min)—677 m/z at 40.7 min = [三氯原酸 acid II - H]-, 677 m/z at 39.4 min = [三氯原酸I - H]-, 515 m/z at 30.7 min = [二氯原酸III - H]-, 515 m/z at 28.6 min =[二氯原酸II - H]-, 515 m/z at 27.9 min = [二氯原酸I - H]-, 353 m/z at 13.2 min = [氯原酸I - H]-. 蔗糖(341 m/z)—387 m/z = [蔗糖+HCOOH - H]-, 683m/z = [蔗糖 + 蔗糖- H]-, 684 m/z = 2nd isotope of [蔗糖 + 蔗糖 - H]-, 1,025 m/z= [蔗糖 + 蔗糖 + 蔗糖- H]- 苯丙氨酸(164 m/z)—165 m/z = 2nd isotopeof[phenylalanine - H]-, 147 m/z= [phenylalanine - NH3- H]-

  18. 生物学样品NMR-LCMS信号的相关性 • LCMS信号×NMR谱峰（3374 × 1008） • 514个显著正相关，47个显著负相关（ α＝0.016% ，6%的数据参与相关性配对） • NMR-LCMS相关性图（ |r| ≥ 0.8 ） • NMR-LCMS显著相关的网状图 • 观察到的NMR-LCMS变量相关性是变量间不同相互作用的结果

  19. Section of the correlation map of NMR–LCMS for tomato fruit: [3.005–6.995 ppm (NMR);2,900–3,100 (LCMS peak number) = (23.12–27.55 min)].Horizontally, the NMR buckets(ppm) of the samples are overlaid and vertically the LCMS peak numbers (peak numbers increase with retention time and m/z) of the samples are overlaid. In the central frame, the correlation coefficients, r, for NMR–LCMS correlations are displayed as a blue-red heat map

  20. 最大的簇A包含>50%的节点，特征性NMR质谱为糖峰（除8.205ppm）,随后的峰可能是甲酸，与一系列信号高度相关，大多糖都是这个簇LCMS信号（游离糖、糖基化的生物碱和皂素）。在5.375、5385和5.395ppm处的峰相当于糖的异头物，与该簇75%信号相关→蕃茄中有丰富的糖基化代谢物。最大的簇A包含>50%的节点，特征性NMR质谱为糖峰（除8.205ppm）,随后的峰可能是甲酸，与一系列信号高度相关，大多糖都是这个簇LCMS信号（游离糖、糖基化的生物碱和皂素）。在5.375、5385和5.395ppm处的峰相当于糖的异头物，与该簇75%信号相关→蕃茄中有丰富的糖基化代谢物。 • 第二大簇B为柚皮素和柚皮酮衍生物信号。8种柚皮素和柚皮酮衍生物可由NMR-LCMS相关性分析法鉴别。本簇有NMR–LCMS相关性信号：山奈酚糖苷→黄酮LCMS和NMR信号的显著相关 是代谢组数据的完善又一途经。

  21. 在0.7 < |r|<0.8的数集中, 发现几个有内相关性信号的代谢产物能相互影响，如蔗糖、Phe和葫芦巴碱。

  22. 推论：由蕃茄代谢谱图分析技术获取的NMR/LCMS中的化学性重有意义。推论：由蕃茄代谢谱图分析技术获取的NMR/LCMS中的化学性重有意义。 • 问题：由NMR/LCMS技术得出同一代谢物的数量有困难。 • 展望：A.随一些技术改进，有助于基于NMR/LCMS技术的代谢谱图分析获取的内相关信号的质量和数量的优化。B.可用于生物标记和未知代谢物的分析和坚定

  23. Thank you

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