1 / 32

大鼠血管平滑肌细胞的培养

大鼠血管平滑肌细胞的培养. 金洪峰. 细胞培养方法. 组织块培养法 消化培养法 器官培养法. 将组织剪成小块后接种于培养瓶 特点：简便易行、成功率较高。. 细胞培养方法. 组织块培养法 消化培养法 器官培养法. 结合生化和化学手段把已经剪切成较小体积的组织进行进一步分离，制成细胞悬液。 主要有： 胰蛋白酶法 胶原酶法 EDTA 法. 细胞培养方法. 组织块培养法 消化培养法 器官培养法. 从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在一定环境中培养，保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。. 体外培养细胞的分型.

ira-ware
Download Presentation

大鼠血管平滑肌细胞的培养

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 大鼠血管平滑肌细胞的培养 金洪峰

  2. 细胞培养方法 • 组织块培养法 • 消化培养法 • 器官培养法

  3. 将组织剪成小块后接种于培养瓶 特点：简便易行、成功率较高。

  4. 细胞培养方法 • 组织块培养法 • 消化培养法 • 器官培养法

  5. 结合生化和化学手段把已经剪切成较小体积的组织进行进一步分离，制成细胞悬液。结合生化和化学手段把已经剪切成较小体积的组织进行进一步分离，制成细胞悬液。 主要有： • 胰蛋白酶法 • 胶原酶法 • EDTA 法

  6. 细胞培养方法 • 组织块培养法 • 消化培养法 • 器官培养法

  7. 从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在一定环境中培养，保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在一定环境中培养，保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。

  8. 体外培养细胞的分型 • 贴附型: 细胞贴附在支持物上生长 • 悬浮型：不贴附于支持物，呈悬浮生长

  9. 准备 • 细胞培养实验室 • 培养用品 • 细胞培养液、培养基

  10. “无菌”

  11. 细胞培养实验室 • 无菌操作区（无菌操作室、 超净台） • 孵育区 • 制备区 • 储藏区 • 清洗和消毒灭菌区

  12. 培养试剂的配制 Hank’s液(单位g) • CaCl2 0.14 • KCl 0.4 • KH2PO4 0.06 • MgSO4.7H2O 0.10 • NaCl 8.0 • NaHCO3 0.35 • Na2HPO4.12H2O 0.12 • D-glucose 1.0 • Phenol red 0.01

  13. 将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中，其它成分溶在750 mL的ddH2O中，混匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟，4℃冰箱保存。

  14. D-Hank’s液 （单位：g） • KCl 0.40 • KH2PO4 0.06 • NaCl 8.0 • NaHCO3 0.35 • Na2HPO4.12H2O 0.08 • Phenol red 0.02

  15. 将以上成分溶于900mL ddH2O中，充分混匀，加ddH2O至1000 mL。高压蒸气消毒10分钟，4℃冰箱保存。

  16. 青霉素、链霉素液配制 • 青霉素80万U加Hank’s液至80 mL，终浓度1万u/ mL • 链霉素100万U（相当于1g）加Hank’s液至100 mL，终浓度10mg/mL • 分装后至-20℃冰箱保存。

  17. DMEM培养液 • 900 mL ddH2O于1000 mL容器中，将DMEM粉1包倒入容器中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力搅拌溶解。 • 加NaHCO3 • 调PH至7.2 • 加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL • 0.22umX50滤膜过滤（负压泵抽吸），4℃冰箱保存。

  18. 小牛、胎牛血清灭活 • 55℃水浴箱30分钟，置4℃冰箱保存 • 灭活前放于-20℃冰箱保存待用 • 临用前加入DMEM液中

  19. 平滑肌细胞原代培养方法 • 动物：大鼠150～180g，2～3只

  20. 操作步骤 • 大鼠颈椎脱臼致死 • 固定

  21. 消毒胸腹部 • 大组织镊、组织剪切开胸腹部皮肤 • 另一组织镊、组织剪切开胸腹部，并切除部分胸壁以利暴露 • 眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有Hank’s液的细胞培养皿中，转入无菌室。或先用生理盐水漂洗，再放Hank’s液中，转入无菌室

  22. 眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层。 • 放入另一盛有Hank’s液的细胞培养皿中，剪去血管外的小分支

  23. 放入含20%胎牛血清的DMEM中，眼科直剪剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻擦拭内膜层，以去除内皮细胞放入含20%胎牛血清的DMEM中，眼科直剪剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻擦拭内膜层，以去除内皮细胞 • 放入另一含20%胎牛血清的DMEM中，用眼科弯剪剪碎血管组织至1mm

  24. 用吸管把组织块转入玻璃培养皿中，均匀贴壁，组织块的间距为0.5cm用吸管把组织块转入玻璃培养皿中，均匀贴壁，组织块的间距为0.5cm

  25. 盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并向瓶内注入适量培养液，于37ºC孵箱内放置4～5小时，使得组织块干涸，并与瓶底贴附盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并向瓶内注入适量培养液，于37ºC孵箱内放置4～5小时，使得组织块干涸，并与瓶底贴附 • 将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置3～5天，切勿移动。待有细胞从组织块周围游离出后换液

  26. 平滑肌细胞传代 • 传代时间：大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕相接触时就可以传代

  27. 传代步骤： • 倒掉培养瓶中的培养液 • 用D-Hank’s液洗两遍 • 加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞消化情况，可见到细胞质回缩，细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞脱离消化液

  28. 注意： • 初次传代对胰酶敏感，加入消化液30s，即消化充分，以后2分钟左右

  29. 细胞消化完成后，用吸管反复抽吸打散细胞 • 中止消化：加入DMEM培养液3滴管，用吸管反复吹打瓶壁细胞 • 离心：1500 X5分钟 • 倒掉液体，加D-Hank’s液洗一次，再加10mL DMEM培养液，用吸管抽吸吹打分散细胞，分装于2个培养瓶。在倒置纤微镜下可见圆形细胞。放入细胞培养箱中培养

  30. 血管平滑肌细胞的冻存和复苏 • 冻存时间：较早期传代，以防细胞因为传代次数过多而造成细胞衰老或发生改变，以保持实验条件的一致性。 • 冻存方法：冻存前24小时更换培养液，冻存时要将密闭好的冻存管依次放于： 4ºC 2小时 -20ºC 2.5小时 液氮表面 2小时 浸入液氮

  31. 培养细胞的鉴定 1、形态学鉴定： 用相差显微镜常规观察细胞生长形态以及生长规律。并依据常规制作电镜标本进行观察 电镜观察结果：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向排列，有密区，具备平滑肌细胞特征

  32. 2、免疫组织化学鉴定： 特异性鼠抗α－平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色 免疫组织化学鉴定结果： 镜下观察到细胞爬片，可见细胞浆内大量平行阳性染色胞核不着色。所有细胞染色，结果均为阳性

More Related