Kapilláris elektroforézis

2. Kapilláris elektroforézis

3. Definíciók • Az elektroforézisnél az oszlop (réteg) két végére elektródokon keresztül feszültség van kapcsolva. • Az oldatban lévő ionok a feszültség hatására elmozdulnak az ellentétes pólusú elektród felé. • Az ionok töltésüktől és „méretüktől” függő sebességgel mozognak (migrálnak). • Az elektroforézis alapjaiban nem kromatográfia, mert nincs megoszlás két fázis között. • A minőségi jellemző a migrációs idő (tm) • Mennyiségi jellemző a csúcsterület (A)

4. Ion sebesség és mobilitás Az ionok sebessége arányos a feszültséggel.

5. Elektroforetikus mozgékonyság függése töltéstől és a súrlódástól

6. Kromatográfiás módok összehasonlítása

7. Különböző kölcsönhatási erők szerepe egyes kromatográfiás módokban Ideális kromatográfiás Módok egyes anyagokra GC Könnyenilló, hőstabil vegyületek HPLC Poláros, nehezen illó, hőre bomló vegyületek EKC Ionos vegyületek A gázkromatográfia túlnyomórészt (70-95%) Forrpont szerinti szelektivitást mutat.

8. Klasszikus gél elektroforézis A feszültség 1-2 kV. Magasabb feszültségnél az oldat felforr a Joule hő miatt. Analízisek több óráig tartanak.

9. Western blots módszer

10. Kapilláriselektroforézis készülék diagramja Oszlop: kvarc, 15-70 cm x 0,02-0,075 mm.

11. A teljes és az effektív oszlophossz

12. Agilent CE instrument

13. Kapilláris előnyei az elektroforézisben • Nagy hőleadás → nagyfeszültségesés → gyors analízisek → nagy hatékonyság • U alakú áramlásprofil • On-column detektálás • Kevés puffer és minta szükséglet • Csekély mintaelőkésztés igény az analízisek közötti gyors, hatékony oszlop regenerálás (0,1 N NaOH) miatt • Egyszerű kezelés

14. A kapilláris kis átmérőjének előnye • A puffer tömegéhez képest nagy a kapilláris felülete, ezért intenzív a hőleadás. • A nagy hőleadás megakadályozza azt, hogy a molekulák pufferben való áramlásakor keletkező súrlódási Joule hő felforralja a puffer. • A nagy sebesség eléréséhez nagy feszültséget (30kV) lehet alkalmazni. • A nagy sebesség gyors analíziseket eredményez. • A nagy sebesség nagy hatékonyságot (100 000-1000000 tp) biztosít

15. Nyomelemzések CE-vel A nagy hatékonyság lehetővé teszi több nagyságrenddel különböző csúcsok egymás melletti meghatározását.

16. CE csekély a mintaszükséglete Mátrix komponensek két analízis között kimoshatók erős vegyszerekkel.

17. Gyors analízisek A rövid oszlophossz és a pufferben oldott reagens teszi lehetővé a nagy sebességet.

18. Gyors analízisek Injektálás a rövidebb detektorhoz közeli végén (fordított polaritás). Az elválasztás 15 cm úthosszon történik.

19. Az elektroozmotikus áramlás kialakulása (EOF) kvarc kapillárisban

20. A töltéssel elrendeződés és a zeta potenciál kvarc kapillárisnál A kvarc kapilláris felületén lévő szilanol negatív töltéssel rendelkeznek pH 3 fölött.

21. Az EOF áramlás profilja Az EOF áramlásprofilja laposabb mint a laminárisé, ezért a minta keskenyebb tartományba oszlik el, azaz nagyobb a hatékonysága.

23. EOF csökkentése és átfordulása pozitív töltésű detergenek hatására Az EOF poliakrilamid vagy teflon borítással is megszüntethető.

24. Rendszerint az EOF nagyobb az ionok saját migrációs sebességénél A nagysebességű EOF miatt az anionok is a katód felé áramlanak.

25. A tényleges és a látszólagos mozgékonyság

26. Az EOF egyenlete

27. Az EOF függése puffer koncentrációjától és az ionerősségtől

28. Az EOF függése a pH-tól és a függés hiszterézise Az egyensúlyi szilanol koncentráció beállása időigényes folyamat. A gyakorlatban nem várják meg az egyensúly beálltát, hanem két analízis között lúggal mossák a kapillárist, ezért az EOF értéke reprodukálható.

29. A különböző kapilláris elektroforézises módszerek Zonális Elektroforézis Izoelektromos fókuszálás Izotahoforézis.

30. A különböző kapilláris elektroforézises módszerek • Zonális elektroforézis: A különböző anyagok eltérő sebességgel haladnak töltésük és méretük szerint. • Izoelektromos fokuszálás: A kapillárison pH gradiens van. Az ampholitok (pozitív és negatív töltéssel is rendelkezetnek) az izoelektromos (semleges) pontjuknak megfelelő helyen koncetrálódnak, és nem vándorolnak tovább. • Kapilláris izotachoforézis: A vizsgált anyagok vezető és záró elektrolit között foglanak helyet vezetőképességűk sorrendjében, és egyforma sebességgel haladnak.

31. Zónás kapilláris elektroforézis

32. Zónás kapilláris elektroforézis Az ionok sebessége függ • A töltésüktől • Töltésük polaritásától • A méretüktől (hidrátburokkal együtt), alakjuktól • A feszültségtől • Az EOF-től • A puffer viszkozitástól

33. Micelláris elektrokinetikus kromatográfia

34. Micelláris elektrokinetikus kromatográfia A minta megoszlik a micellák és a háttér puffer között. A micellákba zárt minta migrációs sebessége eltér a háttér pufferben lévő molekulák sebességétől A töltéssel rendelkező micellákkal semleges molekulákat is el lehet választani

35. A kapilláris elektroforézis alkalmazásai