第三十六章 微生物检验的质量控制

1. 第三十六章微生物检验的质量控制

2. 质量控制（Quality control） • 是临床微生物学实验室为了保证检验结果实事求是地反映客观存在而建立的操作程序体系。在微生物学检验的过程中，定性试验、手工操作、主观判断是主要的工作方式，容易导致错误的结果。如何在操作过程避免这些可变因素对结果的影响，保证结果的准确性、可靠性和可重复性，是质量控制的主要目标。

3. 微生物检验的质量控制 • 室内质量控制 • 室内质量控制是由实验室内部制定并实施的，是质量保证的核心和基础 • 室间质量控制评价 • 室间质量控制评价是由实验室外部的组织或机构对实验室进行的质量评价

4. 第一节   室内质量控制

5. 一、人员与组织管理 • 必须经过广泛的基础训练教育，包括微生物学、医学基础、临床医学知识的学习，专业化的实验技能培训。 • 需要在实际工作中接受有经验的微生物学家监督下的日常严格训练。 • 除了专业理论知识和操作技能外，技术人员高度的责任心和高尚医德是特别需要的。

6. 人员与组织管理 • 所有微生物检验的技术人员必须不断学习 • 继续教育、短期或长期的培训班，去设备先进、业务水平高的实验室进修。参加学术交流会，专题讨论会，及时研读近期专业期刊。

7. 人员与组织管理 • 微生物实验室内应至少配有一名经严格训练并长期从事于微生物检验的技术人员 • 全面负责，指导、培训和考核下级和新进的技术人员 • 与临床医师和护理人员经常性接触，传输微生物学的新知识、新进展 • 随时了解微生物实验室的报告质量。

8. 二、操作手册 • 实验室内必须要具备一本根据本实验室条件而编写的标准操作程序手册。 • 间隔一段时间进行修订，删去过时淘汰的内容，补充新的技术方法。 • 赋予手册近似于法律的地位，使之成为全体工作人员操作时共同遵守的标准程序。不得随意更改或简化。

9. 操作手册一般包括以下内容： 1、  各级人员的职责和权限 2、  实验室安全措施 3、  标本采集和处理指南 4、  本室开展的检验项目及最低鉴定要求 5、  培养基和试剂的配制方法 6、  质量控制方案 7、  常用参考数据 8、  其他制度

10. 三、培养基的质量控制 • 培养基是分离培养微生物的必需品。 • 质量直接关系到分离培养的成败。 • 对来自著名的微生物培养基生产公司的培养基，质量比较稳定。只要按照说明书的要求贮存，在有效期内使用可获得满意效果。 • 对自制的培养基应进行以下程序的质量控制。

11. 原材料的挑选 • 制作培养基的原材料，成分复杂，变异较大。应挑选各成分较稳定的试剂，各种化学试剂一般应选用分析纯。 • 制作MH培养基的原材料，尚有胸腺嘧啶和Ca++ 、Mg++离子浓度的要求。 • 使用干粉培养基配制时，应对每一批号的干粉培养基进行登记并进行以下的质控程序。

12. 配制过程 • 按照实验室内操作手册中，培养基的配制方法、配制步骤和注意事项进行。 • 作好配制记录及培养基上的标签，注明培养基的名称，本批配制量、配方、配制者，配制日期以及有效日期。

13. 培养基的一般质量控制 • 外观 • 每种培养基均应标注清楚。 • 培养基应澄清，无混浊，有浓度要求的培养基如1%马尿酸钠培养基应观察失水情况，使用时需补充失去的水分，最好使用螺旋盖试管。 • 固体培养基应无菌落生长，不干裂。 • 一般平板培养基2-8℃可贮存1-2周。用塑料袋密封，冷藏可使用一月，兔血平板至多用一周。培养基与容器边缘分离则应弃去不用。

14. 无菌试验 • 培养基制作完成灭菌后，应对每批培养基的灭菌效果进行检测。 • 分装后进行灭菌的培养基一般随机抽取5%-10%的量，置35℃孵箱中24小时，证明无菌生长为合格。 • 无菌手续分装的培养基则应将全部培养基置35℃孵箱中24小时，进行无菌试验。 • 对选择性培养基，应取部分培养基加入10-20倍无抑制性肉汤培养基如TSB，稀释抑制物质，置35℃孵箱中24小时，证明无菌生长为合格。

15. 培养基的量 • 斜面培养基的长度不超过试管的2/3。双糖铁培养基，底层至少有1cm的直立段。 • MH平板的厚度应为4mm，即直径为90mm的平皿，注入25ml的培养基即可。 • 其他平板厚度一般为3mm，在90mm直径的平皿中注入15-20ml的培养基。

16. 培养基pH • 配制完成的培养基其pH应与规定的pH相差±0.2之内， • 应在室温条件下用pH计法测定。 • 不宜用试纸或目视比色法测定。

17. 性能试验 • 每一批新配制的、新购入的培养基，无论是分离，选择和鉴别培养基，均应用已知性质的标准菌株进行预测。能否达到预期目标，合格者方可使用。

18. 培养基 质控菌株 判定标准 羊血琼脂平板 生长试验 溶血反应 杆菌肽敏感（纸片法） Optochin敏感（纸片法） 金黄色葡萄球菌ATCC25923 大肠埃希菌ATCC25922 肺炎链球菌ATCC19615 化脓性链球菌ATCC6305 化脓性链球菌ATCC6305 B群链球菌 肺炎链球菌 涎链球菌 生长 生长 生长，α溶血 生长，β溶血 >10mm，敏感 <10mm，耐药 15~18mm，敏感 <15mm，耐药 测定各种培养基性能的菌种

19. 巧克力色血琼脂平板 生长试验 淋病奈瑟菌 脑膜炎奈瑟菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 生长 SS平板 鼠伤寒沙门菌 伤寒沙门菌 福志贺菌 大肠埃希菌 肠球菌 生长，黑色菌落中心 生长，无色透明菌落 生长，无色透明菌落 部分抑制生长，红色混浊菌落 部分抑制生长 测定各种培养基性能的菌种

20. 麦康凯平板 大肠埃希菌 伤寒沙门菌 生长，红色混浊菌落 生长，无色透明菌落 中国蓝琼脂 大肠埃希菌 伤寒沙门菌 生长，蓝色菌落 生长，无色菌落 营养琼脂 金黄色葡萄球菌 福志贺菌 大量生长 大量生长 厌氧血平板 脆弱拟杆菌 产气荚膜梭菌 生长 生长，β溶血 测定各种培养基性能的菌种

21. 弯曲菌琼脂 空肠弯曲菌 大肠埃希菌 生长 部分抑制 TCBS平板 霍乱弧菌 副溶血性弧菌 生长，黄色菌落 生长，蓝绿色菌落 沙保弱琼脂 白色念珠菌 大肠埃希菌 生长 部分或完全抑制 需氧血液增菌液 肺炎链球菌 化脓性链球菌 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 生长 测定各种培养基性能的菌种

22. 厌氧血液增菌液 脆弱拟杆菌 生长 碱性蛋白胨水 霍乱弧菌 大肠埃希菌 大量生长 抑制生长 测定各种培养基性能的菌种

23. 培养基 阳性对照菌 阴性对照菌 赖氨酸脱羧酶 迟缓爱德华菌 费枸橼酸杆菌 鸟氨酸脱羧酶 产气肠杆菌 费枸橼酸杆菌 精氨酸双水解酶 阴沟肠杆菌 普通变形杆菌 蛋白胨水（靛基质） 大肠埃希菌 阴沟肠杆菌 各种鉴别培养基的测试菌种

24. 葡萄糖磷酸盐蛋白胨水 MR V-P 大肠埃希菌 阴沟肠杆菌 阴沟肠杆菌 大肠埃希菌 枸橼酸盐（西蒙氏） 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌 苯丙氨酸脱氨酶 雷极变形杆菌 费枸橼酸杆菌 各种鉴别培养基的测试菌种

25. O-F试验管（葡萄糖） 铜绿假单胞菌（氧化型） 大肠埃希菌（发酵型） 洛菲不动杆菌（不利用） 硝酸盐还原 大肠埃希菌 洛菲不动杆菌 胆汁-七叶苷 粪肠球菌 化脓性链球菌 脱氧核糖核酸琼脂 粘质沙雷菌 表皮葡萄球菌 氰化钾肉汤 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌 各种鉴别培养基的测试菌种

26. 丙二酸盐 产气肠杆菌 迟缓爱德华菌 尿素琼脂 雷极变形杆菌（快） 肺炎克雷白菌（慢） 大肠埃希菌 半固体琼脂动力试验 大肠埃希菌 肺炎克雷白菌 各种鉴别培养基的测试菌种

27. 用于测试分离培养基性能的菌株 • 原则上应使用预期最难生长的细菌菌种，并且应少量接种。 • 将接种物制成0.5管McFarland标准浊度管的浓度，以1: 10稀释后，接种0.001ml接种于培养基上。 • 如需观察多项性能，可使用多种菌株来完成， • 如羊血琼脂平板 • 用乙型溶血性链球菌观察透明溶血情况 • 用草绿色链球菌观察草绿色溶血情况。

28. 选择性分离培养基 • 应能使目的菌生长，而其他菌受抑制不生长。 • 选择性增菌培养基可使用一定比例的目的菌与其他菌的混合菌液接种，观察目的菌是否增殖，而其他细菌则被抑制生长。

29. 四、 试剂、抗血清和染色液的质量控制

30. 试剂及染色液 • 用于测定细菌各种生物学特性的试剂，必须注明配制或购入的日期，并须注意有效日期及贮存条件。 • 由于试剂的稳定性不一致，有时须在测试同时进行阳性和阴性对照试验。

31. 抗血清的质量控制 • 抗血清的来源必须可靠。并根据制造者的使用说明，使用与保存。应在抗血清上注明购入的日期。 • 如为冻干制品，则还应注明配成水溶液的日期。 • 未使用的抗血清应澄清。任何混浊与颜色改变，应视为杂菌污染，不应使用。 • 第一次使用时，应用已知菌效价和特异性进行测定。合格者方可使用。 • 以后每次使用时须观察是否澄清透明，每月用标准菌株进行一次测定。

32. 试剂 阳性对照菌 阴性对照菌 监控频度 新鲜血浆（凝固酶测定） 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 每天 3%过氧化氢 金黄色葡萄球菌 A化脓链球菌 每天 5μg/片新生霉素纸片 金黄色葡萄球菌 腐生葡萄球菌 每批 “x”因子试剂条 嗜沫嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 每批，以后每周 “v”因子试剂条 副流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 每批，以后每周 各种试剂的监控菌种试剂

33. “x+v” 因子试剂条 流感嗜血杆菌 副流感嗜血杆菌 嗜沫嗜血杆菌 氧化酶试剂 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 每批，以后每次 靛基质试剂 大肠埃希菌 产气肠杆菌 每批，以后每天 甲基红试剂 大肠埃希菌 产气肠杆菌 每批，以后每周 V-P试剂 产气肠杆菌 大肠埃希菌 每批，以后每周 各种试剂的监控菌种试剂

34. 硝酸盐还原试剂 大肠埃希菌 醋酸钙不动杆菌 每批，以后每周 三氯化铁（苯丙氨酸脱氨酶试验） 奇异变形杆菌 大肠埃希菌 每批，以后每周 三氯化铁（马鸟酸钠水解试验） B群链球菌 A群链球菌 每批，以后每次 10%去氧胆酸钠 肺炎链球菌 涎链球菌 每批，以后每周 各种试剂的监控菌种试剂

35. 染色液 阳性对照菌 阴性对照菌 监控频度 革兰染色液 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 每天 萋-纳抗酸染色液 结核分支杆菌 每次 阿尔培特异染颗粒染色液 白喉棒状杆菌 每次 密尔荚膜染色液 肺炎克雷白菌 每批 鞭毛染色液 普通变形杆菌 福志贺菌 每次 各种染色液的监控菌株染色液

36. 抗血清 监控菌株 肺炎链球菌 肺炎链球菌 链球菌 A群 B群 C群 D群 化脓性链球菌 无乳链球菌 似马链球菌 粪肠球菌 常用的抗血清和监控菌株

37. 致病性大肠埃希菌 多价Ⅰ 多价Ⅱ 多价Ⅲ 大肠埃希菌O26：B6 大肠埃希菌O86：B7 大肠埃希菌O18：B21 常用的抗血清和监控菌株

38. 志贺菌属 A群 B群 C群 D群 痢疾志贺菌 福志贺菌 鲍志贺菌 宋内志贺菌 常用的抗血清和监控菌株

39. 沙门菌 A~F群多价 A群：O2;a B群：O4;b;1,2 O4;i;1,2 C1群：O6,7;k;1,2 O6,7;c;1,5;vi C2群：O6,8;d;1,2 D1群：O9;gm O9;d;vi E群：O3,15;eh;1,6 F群：O11;i;1,2 沙门菌属、种 甲型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 鼠副伤寒沙门菌 汤卜逊沙门菌 丙型副伤寒沙门菌 弗吉尼亚沙门菌 肠炎沙门菌 伤寒沙门菌 钮因顿沙门菌 阿伯丁沙门菌 常用的抗血清和监控菌株

40. 抗生素与抗生素纸片 • 用于诊断的抗生素纸片 • 用于指导临床抗菌治疗的体外药敏试验用抗生素粉剂、原液和纸片。

41. 抗生素与抗生素纸片贮存 • 常用的抗生素粉剂、原液和纸片容易失效，应贮存于—20℃条件中。从制造日起，保存一般不超过一年。 • 对日常工作需要的抗生素则可贮存于4℃冰箱中，效期为1周。

42. 体外抗菌药物敏感试验的质量控制 • 体外抗菌药物敏感试验是临床进行抗菌治疗的指导性实验，其结果的正确性直接关系到抗菌治疗的成败。 • 临床上常用的方法有纸片扩散法和稀释法 • 操作繁琐，影响因素多

43. 纸片扩散法的质量控制

44. 药敏实验的培养基 • 合格的MH琼脂 • 每批新购入的MH琼脂应使用标准菌株、已知在控的药敏纸片和标准方法进行测试，符合要求才可使用。 • 培养基的制作应按照规定执行，平板厚度应为4mm • （相当于在直径为150mm的平皿倒60-70ml,直径为100mm的平皿倒25-30ml培养基）

45. 药敏实验的培养基 • 无菌试验合格。 • 普通储存条件（2-8℃）下可使用7天。 • 使用前将平板放35℃孵育箱30min，使平板中培养基表面不残留多余的水分。 • 保存过久或脱水严重的平板，不应使用。

46. 药敏实验的培养基 • 室温下MH琼脂的pH应为7.2-7.4 • pH过低，降低氨基糖苷类和大环内酯类抗生素的抗菌活性，增强青霉素类抗生素的抗菌活性 • 可使用表面电极来测量已制作完成的平板。

47. 药敏实验的培养基 • MH培养基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量尽可能低 • 过量的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶抵消磺胺类和甲氧苄胺嘧啶的抗菌效应，抑菌环缩小甚至消失，导致假耐药报告。 • 可用磺胺甲基异恶唑/甲氧苄胺嘧啶纸片对粪肠球菌ATCC29212或ATCC33186在MH平板上进行测试，如有清晰的抑菌环，直径大于等于20mm，则为胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量合格。

48. 药敏实验的培养基 • Mg2+和Ca2+等离子的含量将会影响氨基糖苷类和四环素的对铜绿假单胞菌的药敏实验结果。含量过高，抑菌环变小，反之则扩大。 • 在MH培养基上不能生长的菌株则应使用改良的培养基 • 嗜血杆菌属用HTM培养基 • 淋病奈瑟菌用GC琼脂基础加生长添加剂 • 肺炎链球菌和其它链球菌用5%脱纤维羊血MH培养基

49. 菌悬液浓度标准 • 常规用于纸片扩散法的菌悬液浓度为1.5×108CFU/ml，相当于0.5管麦氏浊度标准管或其它光学 • 等同物（如乳胶颗粒悬液）。浊度标准管应按规定配制，并用分光光度计在625nm处测定吸光度值为0.08-0.10，为符合标准。 • 每月更换标准管。 • 使用前用旋涡混合仪剧烈振荡混匀（乳胶颗粒悬液只能用手振摇）后使用。

50. 含药纸片 • 纸片含药量高低是影响抑菌环大小的重要因素 • 影响纸片含药量的因素： • 直径、密度、吸水性、纸片本身的酸碱度、金属离子等 • 制备方法：以冷冻干燥法制备的质量最好