HROMATOGRAFIJA

1. Metode razdvajanja HROMATOGRAFIJA Hromatografija (od grč. Χρώμα - chroma, boja i γραφειν - grafein pisati) je opšti naziv za grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje i izdvajanje komponenata iz različitih smeša. Kretanjem ispitivane smeše, rastvorene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu fazu“ delovi smeše se razdvajaju i izoluju. - analitička - preparativna

2. Metode razdvajanja HROMATOGRAFIJA Različita raspodela komponenata uzorka između dve faze, od kojih je jedna nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna) u odnosu na prvu. Eluacija

3. HROMATOGRAFIJA Pojmovi u hromatografiji Analit je supstanca koja se razdvaja u hromatografiji. Analitička hromatografija se koristi za određivanje prisustva i koncentracije analita u uzorku (smeši). Preparativna hromatografija služi za prečišćavanje supstanci za određene svrhe (ne za analizu). Hromatogram je vizualni prikaz rezultata hromatografskog postupka. Svakoj supstanci odgovara određeni pik na hromatogramu. Eluent je komponenta separacijskog sistema koja pokreće uzorak kroz kolonu. Efluent je kompletna mobilna faza koja izlazi iz kolone

4. HROMATOGRAFIJA Pojmovi u hromatografiji Stacionarna faza je supstanca koja je fiksirana u koloni (GC i LC) ili ploči (npr. silikagel u TLC), na čijoj se površini određeno vreme zadržavaju supstance koje se razdvajaju. Mobilna faza je faza koja se kreće u određenom pravcu. Može biti tečna (LC) ili gasovita (GC). Mobilna faza se kreće kroz kolonu noseći uzorak koji se razdvaja. Retenciono vreme je vreme za koje analit prođe kroz hromatografski sistem u određenim uslovima. Hromatograf je instrument za hromatografiju.

5. HROMATOGRAFIJA Hromatogram

6. Hromatogrami

7. HROMATOGRAFIJA Klasifikacija hromatografskih metoda Različitikriterijumi: - fizičko-hemijski fenomeni koji se dešavaju prilikom razdvajanja (mehanizmi razdvajanja) - fizičko stanje faza - tehnike Priroda molekula koji se hromatografski razdvajaju određuje tip (vrstu) čvrstog matriksa (faze) koji će se koristiti.

8. MOBILNA FAZA MOBILNA FAZA MOBILNA FAZA MOBILNA FAZA MOBILNA FAZA Opšti pregled najčešćih retencionih mehanizama koji se primenjuju u različitim vidovima hromatografije. PODEONA HROMATOGRAFIJA ADSORPCIONA HROMATOGRAFIJA JONOIZMENJIVAČKA HROMATOGRAFIJA EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA AFINITETNA HROMATOGRAFIJA

9. Klasifikacija hromatografskih metoda Kolonske tehnike Laminarne tehnike

10. Klasifikacija hromatografskih metoda Kolonske tehnike: - tečna kolonska hromatografija - visokopritisna tečna hromatografija (HPLC - High-performance liquid chromatography) - gasna hromatografija • Laminarne tehnike: • hromatografija na tankom sloju • (TLC- Thin layer chromatography) • - papirna hromatografija

11. Klasifikacija hromatografskih metoda • Tečna hromatografija: • Adsorpciona (tečno/čvrsto), npr. TLC i HPLC • Jonoizmenjivačka (Jonska) • Podeona (Particiona) (tečno/tečno) • Gasna hromatografija: • Gas/tečno • Gas/čvrsto

12. Adsorpciona hromatografija Mobilna faza koja može biti tečnost ili gas se prenosi duž čvrste faze (adsorbensa). Ravnoteža između mobilne i stacionarne faze definiše separaciju različitih supstanci iz smeše. Separacija različitih molekula zavisi od serije pojava adsorpcija / desorpcija Čestice iz mobilne faze adsorbovane na površini adsorbensa (adsorbat) Koncentracija supstance u stacionarnoj fazi Čvrsta faza (adsorbens) Adsorpciona izoterma Koncentracija supstance u mobilnoj fazi

13. Adsorpciona hromatografija Adsorbensi koji se koriste u adsorpcionoj hromatografiji Jačina adsorpcije  granulacija (površina adsorbensa), aktivacija, saturacija (H2O) Adsorpcija nepolarnih molekula raste sa porastom njihove veličine (mol. mase) Adsorpcija polarnih molekula raste sa polarnošću grupa. Rastvarač razvijanje hromatograma  eluaciona sposobnost (zavisi od polarnosti, odnosno dielektrične konstante)

14. Metode za razvijanje (i analizu) hromatograma Frontalna metoda analize Metoda istiskivanja Eluaciona metoda analize

15. Podeona hromatografija Razdvajanje se vrši između mobilne faze koja može biti tečna (rastvarač) ili gasovita (gas-nosač) i tečne stacionarne faze koja je naneta na inertni nosač. Ravnoteža između mobilne tečne i stacionarne tečne faze (koje se ne mešaju) određuje separaciju različitih supstanci iz smeše. Separacija komponenata iz smeše se bazira na njihovoj preraspodeli između dve tečne faze (relativnoj rastvorljivosti komponenata smeše) Ispitivana supstanca rastvorena u tečnoj stacionarnoj fazi koja se nalazi na površini inertnog nosača -normalne faze -obrnute faze Kolonska tehnika Laminarna tehnika

16. Hromatografija na izmenjivačima jona Razdvajanje supstanci se vrši između mobilne tečne faze i specifične čvrste stacionarne faze (smola) koja sadrži labilno kovalentno-vezane jone. Joni nosača se mogu reverzibilno i u ekvivalentnim količinama vezivati i zamenjivati drugim jonima iz rastvora električnim silama. Mobilni anjoni se zadržavaju u blizini katjona koji su kovalentno vezani za nosač (stacionarnu fazu) Anjon-izmenjivač Katjon-izmenjivač Anjon-izmenjivačka smola: samo anjoni mogu biti privučeni

18. Hromatografija na molekulskim sitima Mobilna tečna, ili gasna faza prolazi kroz porozni gel koji ima ulogu separatora molekula iz smeše na osnovu veličine. Pore su najčešće veoma sitne čime se veliki molekuli isključuju. Rezultat ove separacije je da veliki molekuli brže prolaze kroz kolonu i zajedno sa mobilnom fazom izlaze sve molekulske vrste dimenzija većih od dimenzija pora. Molekulska sita – visoko umrežena nerastvorna organska jedinjenja u obliku gela Veliki molekuli se odvajaju Gel-filtracija Porozne partikule nosača Kolona Mali molekuli prolaze kroz pore partikula nosča Mali molekuli Veliki molekuli Kolonska tehnika Molecular exclusion chromatography

19. Afinitetna hromatografija Veoma selektivna. Pogodna za izdvajanje komponenata iz biohemijskih smeša. Razdvajanje bazira na interakciji između specifične vrste molekula iz rastvora i molekula koji su imobilisani na stacionarnoj fazi npr. imobilisani molekul na stacionarnoj fazi može biti antitelo za izdvajanje specifičnog proteina. Specifičan molekul u smeši vezuje se za “kompatibilan” molekul kovalentno vezan za stacionarnu fazu Ostali molekuli prolaze kroz kolonu

20. Afinitetna hromatografija Bazira na visoko specifičnoj biološkoj interakciji, npr. između antigenai antitela, enzimai supstrata, receptorailiganda. • Pogodna za: • -prečišćavanje molekula iz smeše • smanjenje koncentracije pojedinih molekula iz smeše • određivanje vrste bioloških materija koje vezuju specifične molekule

21. Klasifikacija hromatografskih metoda TLC Hromatografska komora Rastvarač Rastvarač

22. Klasifikacija hromatografskih metoda TLC TLC mastila TLC automatski sistem

23. Hromatografija na koloni Pri hromatografskom razdvajanju supstanci u koloni, dužina puta l=const, hromatogram predstavlja zavisnost koncentracije od vremena ili zapremine mobilne faze. Kvalitativna i kvantitativna analiza hromatograma.

24. Gasna hromatografija Kolonska tehnika Adsorpciona Podeona – veća primena Supstance koje se ispituju su na sobnim temperaturama u gasnom obliku, zagrevanjem prelaze u gasno agregatno stanje, ili se specifičnim reakcijama mogu prevesti u isparljiva jedinjenja. Razdvajanje se odvija između mobilne faze (gas nosač) i stacionarne tečne faze (nalazi se na sprašenom inertnom nosaču, ili prekriva unutršnji zid kolone)  različiti koeficienti raspodele (rastvorljivosti) – eluaciona analiza. Kvalitativne karakteristike  retencina vremena (zapremine) Kvantitativne karakteristike  površine (visine) pikova

25. Klasifikacijahromatografskihmetoda Analitička tehnika za separaciju komponenata iz smeše koje su prisutne, ili se mogu dovesti (zagrevanjem) u gasno agregatno stanje. Iz hromatograma se dobijaju podaci o kvalitativnom i kvantitativnom sastavu smeša (uzoraka). Prolazeći pod visokim pritiskom u gasnom obliku, komponente se razdvajaju i raspodeljuju između stacionarne faze (može biti tečna, ili čvrsta) i mobilne faze koja je gas. Različita preraspodela (vremenska i prostorna) komponenata u stacionarnoj fazi rezultira hromatogramom. Gasna hromatografija – Gas chromatography [GC]

27. Gasna hromatografija Manometar za merenje pritiska gasa nakon redukcije Manometar za merenje pritiska gasa u boci Integrator Regulacija protoka gasa nosača Detektor Redukcioni ventil Pojačavač el. signala Pisač Hromatografska kolona Termostat (do 400 °C) Gas-nosač Helijum Azot Argon 15 MPa Injekcioni blok

28. Gasna hromatografija Gas nosač Helijum Argon Azot Kolone Preparativne Analitičke Punjene – inertni nosač impregniran likvidnom fazom Kapilarne Standardne punjene kolone imaju prečnik 1.5 – 10 mm, dužinu nekoliko metara, sadržaj likvine faze 5 – 30%, inertni nosač ima prečnik čestica 100 – 500 m Standardne kapilarne kolone mogu imati unutrašnji zid prevučen likvidnom fazom, ili unutrašnji zid prevučen likvidnom fazom u koju je speašen inertni nosač. Unutrašnji prečnik je do 1 mm, a dužina do 200 m

29. Klasifikacija hromatografskih metoda Visokopritisna tečna hromatografija – Highperformance liquid chromatography [HPLC] Jedna od najmoćnijih metoda u analitičkoj hemiji. Izdvaja, identifikuje i kvantifikuje komponente iz smeša (uzoraka) koje su rastvorljive u tečnosti. Mogu se izdvojiti komponente smeša koje su prisutne u tragovima (milioniti, bilioniti deo). Primena – u farmaceutskoj, kozmetičkoj, prehrambenoj industriji, forenzici, ekologiji...

31. Klasifikacija hromatografskih metoda HPLC SISTEM

34. Centrifugiranje Centrifugiranje je sedimentacija čestica pod uticajem centrifugalne sile i upotrebljava se za razdvajanje vrlo finih suspenzija. Kod centrifugiranja se koriste sile do 10 000 puta veće od sile gravitacije, a kod ultracentrifuga i do 600 000 puta veće. Upotreba: -kada se iz koncentrisanih suspenzija izdvaja čvrsta supstanca ili se iz emulzije izdvaja disperzna faza oddisperznog sredstva • bubanj se okreće velikom brzinom na horizontalnoj ili vertikalnojosovini

35. Centrifugiranje Brzina kretanja čestica je u funkciji rezultanti sila koje ubrzavaju i koje usporavajukretanje čestica u datom sistemu. Sila koja ubrzava kretanje čestica je centrifugalna Fc, dok su sile koje usporavaju kretanje čestica sila potiska i sila unutrašnjeg trenja.