Genotoxicitás

1. Genotoxicitás Genotoxicitási tesztek Bakteriális reverz mutáció teszt In vitro mikronukleusz teszt

2. A genotoxicitás szintjei Kromoszóma típusú mutációk (szerkezeti, számbeli változás) Pontmutációk egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése silent, missense, nonsense frame-shift, leolvasási keret eltolódása A genotípus megváltozása nem mindig vezet a funkció (fenotípus) megváltozásához (silent=csendes mutációk, mutáció nem kódoló régióban) A mutáció lehet: káros, semleges, előnyös

3. Mutagén – Karcinogén • a mutagén fizikai vagy kémiai ágens, mely növeli a mutációk képződésének gyakoriságát • indukált mutáció a mutagének által okozott változások a genetikai állományban • a halálozások oka a civilizált világban 40%-ban rákos daganat • - a rákos megbetegedések közel 90%-át a környezetünket szennyező mutagének okozzák • - a mutagén vegyületek nagy része rákkeltő (karcinogén) is !!!!!!!!!!!! • - évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak elő, amelyek korábban nem léteztek a Földön (gyógyszer alapanyagok, növény- vagy faanyagvédő szerek, élelmiszer-adalék, kozmetikum, háztartási vegyszer stb.) • a mutagének és a karcinogének közötti szoros kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben lévő mutagén vegyületek kimutatását

4. Spontán mutációk • okai : • a bázisok alternatív formái (keto/enol, amino/imino tautomerizáció) • a replikáció során a szálak elcsúszása következtében kisméretű inszerciók és deléciók keletkezése • - a DNS szerkezeti változásai (depurináció és deamináció, amelyek a bázisok párosodási tulajdonságait változtatják meg)

5. Tautomerizáció Normál bázispárosodás (keto és amino formák) A guanin enol formája timinnel, az adenin imino formája pedig citozinnal képes H-híd kialakítására. A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására. A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul

6. Indukált mutációk • külső okokból származó mutációk • vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat: • bázis analógok a DNS-be beépülnek, de nem a megfelelő bázissal párosodnak • alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok a DNS bázisok szerkezetét és párosodási tulajdonságait megváltoztatják • interkaláló szerek a bázisok közé ékelődnek és nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak

7. Bázis analógok a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz a kettős spirálba beépíti pl. 5-brómuracil (5BU) timin analóg adeninnel és guaninnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>5BU-A>5BU-G>C-G C-G>5BU-G>5BU-A>T-A 2-aminopurin (2AP) adenin analóg a timinen kívül citozinnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>T-2AP>C-2AP>C-G C-G>C-2AP>T-2AP>T-A

8. Alkiláló szerek alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl. etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

9. Deamináló szerek a spontán deamináción kívül különböző vegyszerek is képesek a bázisok amin csoportjait támadni pl. salétromossav a citozint, az adenint és a guanint támadja citozin uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranziciót okoz adenin hipoxantin, ami citozinnal párosodva T-A > C-G tranziciót eredményez guanin xantin, ez elsősorban citozinnal, de kisebb mértékben timinnel is párosodva C-G > T-A tranziciót hoz létre hidroxilamin a citozin amino csoportját támadja, és hidroxilaminocitozin keletkezését okozza a hidroxilaminocitozin adeninnel párosodik, és C-G > T-A tranziciót okoz

10. Interkaláló vegyületek - általában gyűrűs vegyületek, melyek térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít - a DNS kettős spirálban egymás melletti bázispár közé képesek beépülni - a beépülés a kettős spirál alakját torzítja, ami azután a replikáció során egy nukleotid kiesését vagy beépülést okozza pl. proflavin akridin sárga etidium-bromid dioxin

11. A genotoxicitás mérése • többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer: • bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Esherichia coli) • eukarióta egysejtűek (pl. Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) • élesztőgombapenészgomba • rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster) • gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak) • növények (lóbab, árpa, vöröshagyma) • in vivo (egér, hörcsög, patkány)

12. Alternatív (= in vitro) genotoxicitási tesztek • állatkísérletek számának csökkentése • gyors (short term study) • - költséghatékony • Végpontok: • pontmutáció • DNS törés • repair (DNS szintézis NEM az S fázisban) • kromoszóma aberrációk

13. Mutációk detektálása • - a fajok nemzedékről nemzedékre mutatott állandósága arra utal, hogy a mutációk bekövetkezése ritka esemény • a valóságban azonban a megfigyelhetőnél jóval több mutáció keletkezik • körülbelül 1,000,000,000,000,000,000 (1018) DNS sérülés minden felnőtt emberben naponta! • kb. 30.000.000.000 (3x1010) sejtünk van . . . (~3x107/nap/sejt) • mivel leggyakoribbak a recesszív mutációk, a legtöbb új mutáció észlelését a dominancia megakadályozza • az új mutációk észlelése ezért a legegyszerűbb a haploid szervezetekben • diploidokban a mutációk kimutatására speciális rendszerek szükségesek • - amutációk gyakorisága alacsony, ezért mutánsokat nagy egyedszámú populációból lehet kimutatni

14. Bakteriális reverz mutagenitási teszt • Kidolgozója, Bruce Ames utánAMES teszt • Validált (OECD Guideline 471) • Pontmutációk észlelésére alkalmas • Több humán genetikai betegség pontmutációkra vezethető vissza. • Baktérium törzsek: auxotróf mutánsok • Salmonella typhimurium: his- : hisztidint és biotint igényel • Escherichia coli: trp- : triptofánt igényel • - nem képesek minimál táptalajon növekedni • megnövelt mutációs érzékenység: • megnövekedett sejtfal áteresztő képesség • DNS hibajavító rendszer kiküszöbölése • metabolikus aktiválás kell: S9 frakció : • patkány májából készült enzimkivonat • a baktériumok nem rendelkeznek oxidatív metabolizáló enzimrendszerrel Nagy populációban bekövetkező ritka mutációs esemény detektálására alkalmas

15. Abaktériumok által képzett telepek Salmonella E. coli

16. Reverzió = back mutáció trp+ Triptofánt szintetizál Triptofánmentes tápközegben életképes trp- Triptofán bioszintézisére képtelen Csak triptofánt tartalmazó tápközegben életképes Salmonella typhimurium his- mutánsainak reverzióját figyelik a tesztelendő vegyületek hatására Reverzió = back mutáció his+ Hisztidint szintetizál Hisztidinmentes tápközegben életképes his- Hisztidin bioszintézisére képtelen Csak hisztidint tartalmazó tápközegben életképes Escherichia coli trp- mutánsainak reverzióját figyelik a tesztelendő vegyületek hatására

17. A teszttörzsek jellegzetességei • Különböző típusú his mutációkat tartalmaznak, ezért a mutáció reverziója történhet: • bázispár szubsztitúcióval • frame-shift segítségével • különböző hatásmechanizmusú mutagén vegyületek mutathatók ki, azaz információt nyújt a • genotoxikus anyagok által előidézett mutációk típusáról

18. A kísérlet kivitelezése

19. A kísérlet kivitelezése S9 – patkány májából készült enzimkivonat S9-et adagolva modellezni lehet az emlősökben lezajló enzimatikus reakciókat, így a bakteriális géntoxikológiai tesztekből következtethetünk a szennyezőanyagok magasabb rendű szervezetekre gyakorolt hatására

20. Pozitív kontroll ellenőrzése

21. Az eredmények értékelése • A kísérleti anyag mutagénnek tekinthető, ha: • A kísérleti anyaggal kezelt lemezek revertánsszámai a kontroll lemezek revertánsszámaihoz képest koncentrációfüggő növekedést mutatnak • A revertánsszámok reprodukálható, biológiailag jelentős növekedést mutatnak legalább egy koncentrációcsoportban, legalább egy baktériumtörzsnél metabolius aktiváló rendszer hozzáadásával vagy anélkül • Törzsek: TA 1535, TA100, TA98, TA 1537 és TA 102 vagy E. coli WP2uvrA • Biológiailag jelentős: törzsenként változik (2-szeres, 3-szoros) • Statisztikai értékelés nem szükséges

22. Továbbfejlesztett Ames teszt (Ames II) 96 lukú mikrotitráló lemezen 6 törzzsel (TAMix) végezhető egyszerre pH indikátor festék a tápközegben (brómkrezol lila) A hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a tápközeget Lila: nem mutáns Sárga: back-mutáns

23. In vitro mikronukleusz teszt Validált (OECD Guideline 487) Kromoszóma mutációk kimutatására alkalmas Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, érzékenyebb, olcsóbb, gyorsabb Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén

24. In vitro mikronukleusz teszt Citotoxikus ágensre adott sejtválasz:

25. In vitro mikronukleusz teszt Citotoxikus ágensre adott sejtválasz:

26. In vitro mikronukleusz teszt - acentrikus kromoszóma fragment – klasztogén anyag - centromérral rendelkező fragment – aneugén anyag (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz A klasztogén anyagok törést okoznak a DNS-ben, így az osztódás során kromoszóma fragmentek veszhetnek el, vagyis mikronukleusz képződhet belőlük. Az aneugén anyagok olyan változást okoznak a sejtosztódásnál, ami aneuploidiához vezet. Az aneuploidia a normális diploid kromoszómaszámtól való eltérés, vagyis például egy teljes kromoszóma elvesztése, avagy mikronukleusszá való alakulása.

27. A mikronukleusz képződés módjai

28. A mikronukleusz képződés módjai

29. A mikronukleusz képződés módjai A genetikai anyag a sejtmembrán felé áramlik. Ezek szerint a mutagén anyaggal való expoziót követően először a sejtmag alakja változik meg, bimbózni kezd, majd a sejtmagból kizárt DNS darabkák mikronukleusz formát öltenek, és ezt követően még a sejtből is kizáródhatnak mini sejt formájában. A: exponált sejt B: metafázis C: poliploid metafázis D: poliploid sejtmag E: szabálytalan sejtmag F: bimbózó sejtmag G: szabálytalan sejtmag és mikronukleusz H: szabálytalan sejtmag és mini sejt

30. In vitro mikronukleusz teszt A kísérlet kivitelezése sejtek felszaporítása kísérleti anyag koncentráció sorával való kezelés, kontrollok rátenyésztés citokelazinB hozzáadásával a tenyésztés terminálása kicseppentés, festés, fedés A kísérlet értékelése mikronukleált binukleáris sejtek összes sejthez való viszonyítása morfológiai kritériumok: MN<sejtmag/3 jól szeparált, nem bimbózó azonos festődési intenzitás a sejtmaggal