PCR 을 이용한 DNA 합성과 전기영동법을 통한 정량분석

1. PCR을 이용한 DNA 합성과전기영동법을 통한 정량분석 20030666 화 학 과 류 대 승

2. Purpose Escherichia coli K12에서 분리, 정제된 chromosomal DNA인 mgsA 의 DNA sequence를 이용하여 mgsA DNA를 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 복제, 증폭하는 메카니즘과 장치 조작법을 익히고, PCR로 인해 얻어진 DNA의 분석을 위한 전기 영동법(Electrophoresis)의 원리를 이해하여 DNA증폭법과 정량법을 익힌다.

3. PCR(polymerase chain reaction) • 1980년대 중반에 Kary Mullis에 의해 고안 • DNA 분자의 단일부위가 여러 번 복제되어, DNA 단편이 증폭되는 원리 • PCR은 매우 간단하면서 감도가 높고 응용범위가 넓어 현대 생명과학에서 가장 중요한 테크놀로지 중의 하나 • PCR은 유전자 클로닝보다 신속한 기술이면서 훨씬 덜 복잡하고, 하나의 출발 분자로 부터 수백만 개의 복사본을 증폭시킬 수 있음. • PCR의 이러한 높은 민감도는 단일세포 또는 이미 말라 버린 혈흔이나 사망한지 오래된 인간의 뼈같은 시료로부터 얻은 미량의 DNA를 증폭할 수 있다는 것을 의미 • 과학수사기법이나 DNA 칩 기술로의 응용, 유전학 연구의 새로운 지평을 연 선구자적 기술

4. 전기영동법(Electrophoresis) • E-field에서 Cation/Anion이 Cathode 또는 Anode 쪽으로 이동하는 현상을 이용 • 이동하는 속도에 미치는 영향 • -전기장의 세기, 이온의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액(Buffer) • 에 있는 다른 전해질의 농도와 이온 세기, 지지체의 종류 등 • -용액 내에서의 분자의 이동속도는 그 분자의 고유한 성질 • 아미노산, 핵산, 단백질 등의 Zwitterion들을 분리, 분석할 때 매우 효과적인 수단 • Electrophoresis는 주로 이온화된 분자(이온)의 정량에 한정된 수단 • 유동성 매체(Medium)로 액체 또는 기체가 사용 • - Agarose 전기영동법은 매체로 아가로스 겔을 이용

5. DNA의 구조 A=T, C≡G의 수소결합 DNA의 인산에스터 결합 (-) charge를 가지고 있다. 이러한 당-인산기의 뼈대 에 염기가 결합하여 DNA를 이룬다. DNA는 각 염기의 상보적 결합으로 인한 이중나선을 이룬다.

6. PCR의 원리 lagging strain 5`end Leading strain 3` end DNA는 항상 5`end→3`end으로 합성됨. 3번탄소의 –OH가 5번탄소의 Phosphate를 공격함 5`end 3`end 3`end 5`end Denaturing된 DNA는 2가닥으로 분리되며 각각이 5` →3방향으로 합성됨.

7. Primer 제작 • mgsA DNA sequence : atggaactga cgactcg……ggaccgt ctgaagtaa • Upstream Primer : atggaactga cgact • Downstream Primer : ctggca gacttcatt • 결합온도(TM), Temperature of melting • ① Tm=(4 x {G+C} + (2 x {A+T})℃ • ② Upstream primer(5`), atggaactga cgact • (4 x {5+2} + (2 x {5+3}) = 54℃ • ③ Downstream primer(3`), ctggca gacttcatt • (4 x {3+4} + (2 x {3+5}) = 54℃ • ※좋은 primer의 조건 • 두 primer의 Tm값이 비슷해야 한다. • g-c: a-t =1:1에 가까운 값을 가져야 한다. • primer-dimer가 되지 않도록 주의한다. • aaaa 등의 같은 sequence가 오지 않도록 한다.

8. Chemicals • Template: 2μℓ, (mgsA) • Upstream primer: 1μℓ • Downstream primer: 1μℓ • dNTP: 5μℓ • 10×완충용액: 5μℓ • 증류수: 35μℓ • Taq DNA polymerase: 1μℓ

9. PCR Running • PCR Cycle : 15회 • Denaturation : 95℃, 5분 • Annealing : 61.5℃, 30초 • polymerization 72℃, 1분 • ⇒ 15회 반복, 처음 DNA양의 32768배로 증폭

10. 전기영동을 통한 DNA의 분리 • Agarose gel을 매체로 이용하여 전기장을 걸어DNA를 분리할 때 사용 • - 전기장에 의한 DNA분자의 이동 • DNA는 deoxyribose가 인산에스터 결합을 하기 때문에 phosphate group 에 의해 (-) charge를 가짐 • - 두 전극 사이에 위치했을 때 (+)극 쪽으로 움직임 • DNA분자가 Agarose gel사이를 통과하는 속도 • - 분자량이 커질수록, Agarose gel이 치밀할수록(gel%가 높을수록) 늦어짐 • - DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라 달라짐

11. Agarose gel 전기영동 결과 증폭시킨 mgsA와 Loading dye를 넣고 전기영동시킨 결과. 왼쪽부터 레더, gldA, mgsA, mgsA, gldA순서. 아래쪽이 (-)극 위쪽이 (+)극. gldA(1104bp) mgsA(459bp) 1kbp의 gldA가 더 밝은 빛을 내는데, 큰 bp크기때문에 EtBr과 더 많이 결합하기 때문. Ladder, 각각의 bp크기별로 혼합되어있어 reference로 쓰인다.

12. DNA전기 영동시의 실험 설정(1) • 100V의 전압 • - 전압이 세질수록 전기장도 커지므로 전기영동 시간 단축 • (100V 20분 실행) • 2) Agarose 격자구조 때문 Agarose의 농도가 높을수록 DNA는 느리게 이동 • - 60~5kbp분리에 적합한 0.3% agarose gel의 농도로 진행 (-)극에 놓인 DNA가 (+)극으로 이동하게 됨 전기영동법의 메카니즘

13. DNA전기 영동시의 실험 설정(2) 3) 1 x TAE buffer (Tris-acetate EDTA) - DNA agarose 전기 영동시 주로 사용, 분자량이 큰 경우 사용 4) Agarose gel - 분자량이 100bp~20kbp인 DNA 사용, 해상력이 낮음 5) DNA Loading dye - Bromophenol Blue (BPB, 파란색)과 Xylene Cyanol (XC, 빨간색) 염색시약 또한 음전하를 띄고 있어 DNA와 같이 이동함 - sucrose, glycerol, NaCl 등이 함유 : DNA가 든 시료를 gel속에 잘 가라앉게함. 6) EtBr (Ethidium bromide) - EtBr 분자가 DNA의 당과 nucleotide 사이에 존재하는 수소결합에 끼어듦 - Ethidium bromide은 자외선(UV, 590nm)를 받으면 오렌지색으로 형광을 내는데, 이것으로 DNA의 양과 존재 유무를 알 수 있음

14. Ethidium bromide(EtBr) DNA이중나선에 끼어드는 헤테로 고리 화합물.DNA의 염기도 헤테로 고리 화합물로 모양이 비슷하게 생겨서 강한 친화력을 가짐

15. Discussion 주형 DNA인 mgsA를 PCR을 통해 대량으로 증폭시켜 보았으며, 증폭시킨 DNA를 전기영동을 통해 정량할 수 있음을 배웠으며, 각 기기들의 사용법과 테크닉, 주의사항을 익힐 수 있었다. 이러한 PCR을 통한 증폭은 필요한 특정 DNA의 부분만을 대량으로 손쉽게 얻어낼 수 있으므로 DNA칩 제작기술에 원천기술이 되며, 매우 강력한 툴임을 알게 되었다. 이상 - 끝 -