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Oxidation-induced intramolecular disulfide bond inactivates mitogen-activated protein kinase kinase 6 by inhibiting ATP binding.

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Presentation Transcript

  1. Oxidation-induced intramolecular disulfide bond inactivates mitogen-activated protein kinase kinase 6 by inhibiting ATP binding YaruiDiaoa, Wei Liua, Catherine C. L. Wongb, Xi Wanga, Kaman Leea, Po-yanCheunga, LifengPana, Tao Xub, JiahuaiHanc, John R. Yates IIIb, MingjieZhanga, and Zhenguo Wua,1 Reporter: Gao Wei Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 7;107(49):20974-9.

  2. 邬振国 香港科技大学生命科学部教授 深圳北京大学香港科技大学医学中心教授 1，阐述了LMP1激活JNK及NF-KappaB信号通路的分子机理。 2，首次发现不同的JAK/STAT信号通路可以调控骨骼肌细胞的分化 及因损伤诱导的骨骼肌再生。 3，阐述了MKK6的蛋白激酶活性受氧化还原状态调控的分子机理。 DiaoY, Guo X, Li Y, et al. Pax3/7BP is a Pax7-and Pax3-binding protein that regulates the proliferation of muscle precursor cells by an epigenetic mechanism[J]. Cell stem cell, 2012, 11(2): 231-241. Xiao, Fang, et al. "Oncostatin M inhibits myoblast differentiation and regulates muscle regeneration." Cell research 21.2 (2011): 350-364. Diao, Yarui, et al. "Oxidation-induced intramolecular disulfide bond inactivates mitogen-activated protein kinase kinase 6 by inhibiting ATP binding." Proceedings of the National Academy of Sciences 107.49 (2010): 20974-20979. Ma, Ning‐Fang, et al. "Isolation and characterization of a novel oncogene, amplified in liver cancer 1, within a commonly amplified region at 1q21 in hepatocellular carcinoma." Hepatology 47.2 (2008): 503-510. Sun, Luguo, et al. "JAK1–STAT1–STAT3, a key pathway promoting proliferation and preventing premature differentiation of myoblasts." The Journal of cell biology 179.1 (2007): 129-138.

  3. “TXY” motif ERKs：extracellular signalregulated kinases JNKs：cJun N-terminal kinases

  4. 整体思路： 1.验证MKK6是Redox sensor 现象 2.验证MKK6形成分子内二硫键 3.鉴定MKK6形成二硫键的关键Cys位点 机制 4.验证MKK6二硫键影响酶活的相关机制 5.验证hMKKs的redox调控具有普遍性 意义

  5. 最初的问题，来源于对p38/MAPK信号通路受ROS调控的探究兴趣最初的问题，来源于对p38/MAPK信号通路受ROS调控的探究兴趣 P38/MAPK信号通路是否因为上游存在Redox sensor，才获得受Redox调控的能力？ 上游的直接调控蛋白MKK6是否就是一个Redox sensor？ 作者团队前期有研究MKK6: Cheung, Po-yan, et al. "p150Glued, Dynein, and microtubules are specifically required for activation of MKK3/6 and p38 MAPKs." Journal of Biological Chemistry 279.44 (2004): 45308-45311.

  6. 验证MKK6是一个Redox sensor 体内外活性检测：(Trx)-6xHis-MKK6和(GST)-p38α(K82M) (kinase-dead) TNF-α (10ng/mL)：激活MAPK/p38 通路 PMA (1 μM): 佛波醇，促进内源性ROS

  7. 通过体内外实验，证实MKK6的活性受氧化还原调控，并且与二硫键形成有关（DTT处理可以恢复活性）。通过体内外实验，证实MKK6的活性受氧化还原调控，并且与二硫键形成有关（DTT处理可以恢复活性）。 初步证实MKK6是一个受氧化还原调控的蛋白（酶活实验证实，现象） 接下来应该是思考如何进一步证实MKK6受氧化还原调控，并深入寻找调控机制。 寻找形成二硫键的Cysteine位点 验证氧化还原调控是通过作用于该位点来实现的

  8. 存在凝胶shift，同时非还原性胶，无多聚体（高分子量条带）：提示极有可能是分子内二硫键，存在凝胶shift，同时非还原性胶，无多聚体（高分子量条带）：提示极有可能是分子内二硫键， 如何进一步确认？ β-mercaptoethanol：β-巯基乙醇，还原剂 C109是激酶活性改变的关键位点

  9. 体外验证：在结构分析假设的基础上，利用Cys突变，进行位点验证体外验证：在结构分析假设的基础上，利用Cys突变，进行位点验证 猜测C109和C196形成二硫键 4C：C38S、C216S、C128L、C128M 通过突变验证，证实C109和C196之间形成二硫键 DTNB巯基检测反应原理： 412nm可见光吸光度检测

  10. 进一步验证C109与C196形成二硫键 先用IAM（碘乙酰胺：烷化剂，与巯基结合）与巯基反应结合。质谱shift: 57.02 Da 还原处理后，再用NEM（N乙基-马来酰亚胺：烷化剂，与巯基结合）与新生成的自由巯基反应。质谱shift: 125.04 Da 质谱检测结果： 还原型MKK6不存在NEM修饰肽段，氧化型MKK6存在125.04Da的shift。

  11. 进一步验证C109与C196形成二硫键 直接将重组的MKK6蛋白进行酶解后质谱检测。 氧化形式的MKK6质谱检测到含有二硫键结构肽段 还原形式的MKK6质谱未检测到含有二硫键结构肽段

  12. 体内验证：C109和C196形成二硫键 A，用Bio-IAM标记HA-MKK6，检测还原形式巯基。 H2O2处理后，4C型MKK6不存在还原形式巯基。 说明未突变的C109和C196是二硫键形成位点。 B，先用IAA（碘乙酸）不可逆与还原巯基结合，再还原处理后用B-IAM标记新生成还原巯基（即原来形成二硫键的巯基）。 C，利用PMA（佛波醇）处理RAW264.7细胞，诱导内源ROS，会减少还原形式的Bio-labled MKK6。

  13. 体内外验证了C109和C196是MKK6形成二硫键的Cys位点。解释了MKK6受氧化还原调控的机制。体内外验证了C109和C196是MKK6形成二硫键的Cys位点。解释了MKK6受氧化还原调控的机制。 如何进一步说明MKK6的活性受氧化还原调控，是基于C109和C196的二硫键调控？ 最开始的现象： MKK6激酶活性受Redox调控。 进一步的机制： MKK6的C109和C196能形成二硫键，并受Redox调控。 ？ MKK6的C109和C96与MKK6激酶活性之间的关系是什么？

  14. 验证质粒转染效果 C109和C196未突变型MKK6，激酶活性收到H2O2影响，而6C型MKK6，酶活不受H2O2影响 说明C109和C196可以影响MKK6活性：胞内氧化可以引起C109和C196形成二硫键，并降低MKK6的激酶活性 Sorbitol:山梨醇，可激活MAPK/p38信号通路

  15. 之前实验已经证实C109和C196可以影响MKK6活性： 胞内氧化可以引起C109和C196形成二硫键，并降低MKK6的激酶活性 二硫键的形成，是通过什么机制影响MKK6的激酶活性？ 1，改变MKK6的空间结构，使酶结构域不能发挥作用？ 2，改变MKK6底物结合域，不能作用于底物？ 3，其他可能？

  16. A，验证MKK6氧化型和还原型二级结构：二级结构没有发生改变A，验证MKK6氧化型和还原型二级结构：二级结构没有发生改变 B，底物p38结合实验证实：氧化和还原状态对MKK6的底物结合能力影响不明显 C，检测MKK6与ATP的结合能力：氧化形式MKK6与ATP结合能力降低。 说明二硫键是通过影响MKK6的ATP结合能力，从而影响MKK6激酶活性。 圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法。 (BODIPY FL-AMPPNP：ATP类似物，作为荧光探针。

  17. 至此，已经证实：MKK6的C109和C196位点会在ROS作用下，形成二硫键，从而阻断MKK6与ATP的结合，导致MKK6失活，不再具备激酶活性。至此，已经证实：MKK6的C109和C196位点会在ROS作用下，形成二硫键，从而阻断MKK6与ATP的结合，导致MKK6失活，不再具备激酶活性。 这种调控是否具备普遍性？ 其他MKK激酶是否也具备类似的调控？（位点、ATP结合能力）

  18. “TXY” motif ERKs：extracellular signalregulated kinases JNKs：cJun N-terminal kinases

  19. A，验证了C109和C196位点在hMKKs具备高度保守性 B，放射自显影：底物磷酸化检测，以JNKK和MKK1为例，验证了其他hMKKs的激酶活性同样受Redox调控

  20. 总结： 验证了MKKs能够通过C109和C196位点的氧化，形成二硫键，从而阻断与ATP的结合，导致失活，不再具备MAPKK激酶活性。

  21. Thank you

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