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组织培养技术简介

组织培养技术简介. 组织培养基本概念. 组织培养（ Tissue Culture ） 细胞培养（ Cell Culture ） 器官培养（ Organ Culture ） 组织培养 体外培养（ In Vitro ） 细胞培养 器官培养. 4. 对组织培养的评价. 优点 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动

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组织培养技术简介

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Presentation Transcript

  1. 组织培养技术简介

  2. 组织培养基本概念 • 组织培养（Tissue Culture） • 细胞培养（Cell Culture ） • 器官培养（Organ Culture ） 组织培养 体外培养（In Vitro） 细胞培养 器官培养

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  4. 对组织培养的评价 • 优点 • 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动 • 便于使用摄影、摄电影和闭路电视等方法进行记录，直接观察活细胞变化 • 可用培养进行研究的细胞广泛 • 便于使用不同的技术方法 • 细胞培养技术已是分子生物学和基因工程的重要组成部分

  5. 对组织培养的评价 • 易于施用物理、化学和生物因素等进行研究 • 是生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段 • 不足 • 人工培养环境与体内环境相比，仍有很大差异。因此在利用培养细胞做实验对象时，不应视为体内细胞完全一样，把实验结果推至体内，轻易做出与体内等同的结论

  6. 培养细胞生存环境、条件 • 无污染环境 • 温度 • 气体环境和氢离子浓度 • 体外培养细胞生存所需基本物质 • 渗透压 • 培养基 • 附着底物

  7. 体外培养细胞成功率的分析 • 培养成功与否的两步考虑 • 培养物是否贴附在底物上 • 扩大再培养 • 影响培养成功的因素 • 组织和细胞供体年龄 • 培养条件 • 贴附底物 • 培养方法 • 是否成功的两步考虑 • 培养物必须贴附在底物上 • 扩大再培养 • 影响培养成功的因素 • 组织和细胞供体年龄

  8. 组织培养设施和基本条件 • 实验室设计 • 原则 防止微生物污染和有害因素影响 • 要求 工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘 • 划分不同功能区或用铝合金隔板隔开 • 无菌操作区应在室内较少走动的内侧 • 清洗和消毒安置在另室

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  10. 组织培养设施和基本条件 • 无菌操作设施和工作间 • 净化工作台 • 侧流式 • 直流式 • 外流式 • 优缺点 • 延长滤垫使用寿命的方法 清洁无尘 纱布 • 滤器淤滞的检测 气流 酒精灯火焰

  11. 组织培养设施和基本条件 • 无菌操作室 • 更衣间 • 缓冲间 应适当宽敞，可设培养箱和离心机 • 操作间 大小适当 • 无菌操作室无日光直射，结构以铝合金为上，天花板不宜高过2.5M，上半部透明，墙壁光滑无死角 • 清洗和准备区 清洗区应与其它区分开 • 温育和贮存区 • 观察和研究区

  12. 组织培养设施和基本条件 • 实验室设备 • CO2培养箱 • 质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过0.5度 • 培养容器需与外界保持通气状态 • 箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精） • 水槽

  13. 组织培养设施和基本条件 • 电热干燥箱 • 烘干和干热消毒玻璃器皿 • 鼓风与升温同时进行，100度时可停止鼓风 • 禁止先升温后鼓风 • 100度以下时再打开箱门 • 金属器械、塑料制品、橡胶等不能在干燥箱内消毒

  14. 组织培养设施和基本条件 • 显微镜 • 水纯化装置 • 很少使用离子交换装置处理的水 • 蒸馏水装置分金属和玻璃两种 • 洗刷装置 • 人工洗刷 • 超声洗涤装置 • 玻璃吸管洗涤

  15. 组织培养设施和基本条件 • 抽滤装置 • 细胞冷冻贮存器 • 离心机 • 小型台式离心机符合分离细胞要求 • 加样器

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  17. 组织培养设施和基本条件 • 器 械 • 解剖刀 • 白内障刀 • 解剖剪 • 虹膜剪 • 镊子 • 注意保护刀锋，钝刀对组织有伤害，不利细胞生长

  18. 组织培养设施和基本条件 • 培养器皿 • 玻璃瓶皿 • 玻璃瓶 • 500毫升、250毫升、100毫升 • 培养瓶 • 培养皿 • 吸管 • 离心管

  19. 组织培养设施和基本条件 • 塑料瓶皿 • 多孔培养板 • 4、6、24、96孔 • 培养皿 • 30、60、100毫米 • 培养瓶

  20. 培养用液 • 水 • 离子交换水 • 带有非离子物质和有机物，在组织培养中很少使用 • 蒸馏水 • 玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水 • 尽量减少开启次数 • 存放时间不宜过长，一般不要超过2周 • 最好现制现用

  21. 培养用液 • 平衡盐溶液 • Hanks • 配制离散细胞的消化液和洗涤液时，宜用钙、镁离子含量低的或无钙、镁离子的溶液 • 可配制成10×浓度的贮存液，用时稀释 • 高压灭菌，冰箱保存 • 浑浊或沉淀时，应重新配制

  22. 培养用液 • 血清 • 为何使用血清 • 血清的选择 • 国产杭州四季青 • 进口 • 同一品牌不同批号的产品存在差异 • 血清评价

  23. 培养用液 • 合成培养基 • 合成培养基的评价 • 有利于控制实验条件标准化 • 只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生长 • 种类 • RPMI 1640 • DMEM • 神经元基础培养液

  24. 培养用液 • 合成培养液的成分 • 氨基酸 几乎所有细胞在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置－20度保存，用前加入培养液内。含谷氨酰胺的培养液在4度贮存2周以上时，应重新加入谷氨酰胺 • 碳水化合物 • 维生素 • 无机离子 • 其他

  25. 培养用液 • 培养液的种类 • 生长培养液 • 基本培养基 80%-90% • 血清 10%-20% • 抗生素（青霉素100单位/ml和链霉素100µg/ml） • 维持液 • 基本培养基 95% • 血清 2%-5%

  26. 培养用液 • 无血清培养基 • 组成 • 基础培养液 • 附加成分（细胞外基质、营养成分、 生长因子）

  27. 培养用液 • 培养基的选择 • 培养成败的关键 • 经验法 • 来自各培养室或文献报道证明哪些培养基对培养某种细胞较合适，作为自己应用的依据 • 实验法 • 多孔培养板做一组克隆形成率和细胞生长曲线

  28. 培养用液 • 其它常用液 • 消化液 • 胰蛋白酶溶液 • EDTA溶液 • pH调整液 • NaHCO3液 • HEPES液 • 抗生素

  29. 清洗与消毒 • 清洗 • 玻璃器皿的清洗 • 浸泡 新瓶使用前用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。培养后的器皿立即浸入水中 • 刷洗 软毛刷沾洗涤剂洗涤 • 浸酸 关键一环。时间不少于6小时，一般过夜。清洁液变绿应重新配制。 • 冲洗 洗涤装置与手工

  30. 清洗与消毒 • 胶塞的清洗 • 新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理 • 常规清洗方法：水中浸泡 2%NaOH煮沸10-20分钟 自来水冲洗 1%盐酸浸泡30分钟 自来水冲洗 蒸馏水清洗2-3次 晾干

  31. 清洗与消毒 • 包装 • 包装材料有皱纹包装纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒及金属消毒筒 • 局部包装 • 全包装 小物品装饭盒，注意期限，标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花

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  33. 清洗与消毒 • 消毒 • 物理消毒 • 火焰 • 紫外线消毒 空气、操作台表面。紫外灯距地面2.5米 • 干热消毒 玻璃器皿 160度保持90-120分钟 • 湿热消毒 布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿某些液体 物品不宜过满 液体和橡胶制品10磅10分钟 布类、金属器械、玻璃器皿15磅20分钟

  34. 清洗与消毒 • 滤过消毒 培养用液 0.22 µm微孔滤膜 • 化学消毒 • 来苏尔 • 新洁尔灭 • 酒精 • 抗生素消毒 • 气体消毒

  35. 组织培养的基本操作和培养技术 • 培养操作基本要领和要求 • 无菌操作 成功或失败的首要条件 • 培养前准备 操作卡片 用品置于场地，然后消毒 • 操作野消毒 • 洗手和着装 • 火焰消毒

  36. 组织培养的基本操作和培养技术 • 培养操作 • 动作准确敏捷 • 不用手触及已消毒物品 • 操作面布局合理 • 操作保持一定顺序 • 培养用瓶和吸管的放置 • 防止各种用液的交叉污染 • 不向操作野讲话或咳嗽

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  40. 组织培养的污染、检测和排除 • 污染途径 • 空气 • 清洗消毒 • 操作 • 血清 • 组织

  41. 组织培养的污染、检测和排除 • 污染对细胞的影响 • 真菌污染 • 大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面 • 镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错 • 细菌污染 • 培养液浑浊 • 镜下可见菌体

  42. 组织培养的污染、检测和排除 • 支原体污染 • 最常见、不易察觉 • 大小介于0.2-2 µm，约1%可通过滤菌器 • 对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效 • “正常”感觉 • 腺苷酸环化酶 • 精氨酸 • 检测

  43. 组织培养的污染、检测和排除 • 微生物污染的排除 • 抗生素法 • 加温除菌法 • 动物体内接种除菌法 • 巨噬细胞吞噬法

  44. 细 胞 冻 存 • 原理 • 冰晶导致细胞损伤甚至死亡 • 甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，避免冰晶 • 融化细胞时，速度要快，迅速通过最易受损的-5-0度

  45. 细 胞 冻 存 • 冻存方法 • 细胞选择 • 计数 密度达5×106/ml • 冻存液 血清或培养液9份＋甘油或二甲基亚砜1份 • 分装 • 封口

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