1 / 21

Immunohistokemi

Immunohistokemi. Cecilia Ottosson Laboratoriemetodik, grundläggande, vt14 Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin. Litteratur. Cellular pathology - kap 10, 13. Immunohistochemical Staining Methods (finns i pingpong) - kap 1 , 2 , 3 , 8, 9 och 17. Immunohistokemi.

jamalia-leblanc
Download Presentation

Immunohistokemi

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Immunohistokemi Cecilia Ottosson Laboratoriemetodik, grundläggande, vt14 Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin

  2. Litteratur • Cellularpathology - kap 10, 13 • ImmunohistochemicalStainingMethods (finns i pingpong) - kap 1, 2, 3, 8, 9 och 17

  3. Immunohistokemi • Identifiering av vävnadskomponenter med hjälp av antikroppar • Immunohistokemi – vävnadsprover Immunocytokemi – cellutstryk • Antigener, ag - epitop • Antikroppar, ak – Immunoglobuliner (Ig) -plasmaceller (B-lymfocyt) -IgG, IgM

  4. Immunohistokemi • Polyklonala antikroppar - immunisering av värddjur - ak mot ett flertal olika epitoper • Monoklonala antikroppar -hybridomteknik -högt specifika, riktade mot endast en epitop

  5. Immunohistokemi • Bindning ag-ak - samverkan mellan jonbindningar, vätebindningar, Van der Waals krafter och hydrofoba bindningar • Visualisering av ak - markörer - kovalent bindning - konjugering, biotinylering

  6. Markörer • Enzymer - horseradishperoxidas (HRP) - alkaliskt fosfatas (AP) • Horseradishperoxidas - substrat: väteperoxid - PRP: syre - kromogen: DAB (diaminobenzidin) AEC (aminoetylkarbazol) • Alkaliskt fosfatas - substrat: α-naftolfosfat - PRP: : α-naftol - kromogen: diazosalter (Fast Red) Substrat  primär reaktionsprodukt (PRP) PRP + kemiskt ämne  slutlig reaktionsprodukt (SRP) SRP – olöslig (precipitat)

  7. Markörer • Fluorescerande molekyler - FITC, Texas Red - fluorescensemikroskop - nackdel: speciellt mikroskop mörkt rum svårt att orientera sig bleknar med tiden • Metaller - guld, silver - vid elektronmikroskopi • Biotin - avidin - ej visualisering!

  8. Ospecifik bakgrund • Ospecifik inbindning av ak - inkubering med proteinlösning innan ak - normalserum • Endogent enzymaktivitet - peroxidas – väteperoxid - alkaliskt fosfats - levamisol • Endogent biotin - avidin

  9. Korsreaktioner • Ak reagerar med en snarlik epitop på annat ag • Ak korsbinder till varandra

  10. Spädning av ak • Optimal spädning – högsta spädningen på ak som ger stark färgningsreaktion med låg bakgrundsfärgning • Högre affinitet – lägre koncentration (hög spädning) • Affinitet – dragningskraften/bindning mellan ak-ag • ”Smarta” spädningar

  11. Inkubering • Tid • Temperatur • Fuktig kammare

  12. Avmaskering • Formaldehydfixerat, paraffininbäddat material • Fixering – maskering av antigen • Enzymatisk behandling - proteolytiskaenzymer (trypsin, proteinase K) - kritisksteg: tid förkorttid – ejtillräckligavmaskering förlångtid – tar bort antigen • Värmebehandling - mikrovågsugn, tryckkokare - citratbuffert, EDTA-buffert

  13. Metoder i ett och två steg • Direkt metod - endast en ak - akmärkt med markör - fördel: snabbmetod - nackdel: lågsensitivitet • Indirekt metod - omärktprimärak - märktsekundärakriktad mot primärak - fördel: känsligaremetod, merekonomisk - nackdel: långsammare

  14. Metoder i tre steg • PAP – peroxidas-anti-peroxidas • APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas • ABC – avidinbiotin komplex • LSAB – labelledstreptavidinbiotin

  15. Enzym-anti-enzymkomplex • PAP – peroxidas-anti-peroxidas APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas • Naturlig affinitet hos en antikropp mot ett antigen (här: enzym) - omärkt primär ak - sekundär ak – ”bro” - enzym-anti-enzymkomplex - substrat och kromogen

  16. Avidin-biotin • ABC (avidin-biotin-komplex) LSAB (labelledstreptavidinbiotin) • Avidins höga affinitet mot biotin - omärkt primär ak - sekundär biotinylerad ak - avidin-biotin/avidin konjugerat med enzym - substrat och kromogen

  17. Immunogold • Ej naturligt i kroppen - primär omärkt ak - sekundär ak märkt med guldpartikel - om ljusmikroskopi: intensifiering med silver - om elektronmikroskopi: olika storlekar på guldpartiklarna → dubbelinfärgning

  18. Polymerkonjugerade system • Dextranmolekyl • Direkt metod - ex EPOS (Enhanced Polymer One-Step Method) • Indirekt metod - ex Envision

  19. Kontroller • Vävnadskontroller - positiv - negativ • Blank

  20. In situ hybridisering • Lokalisering på vävnad • Märkta DNA strängar – fluorescense (FISH) kromogen (CISH) silver (SISH)

  21. In situ hybridisering • Små mängder prober • DEPC, EDTA, formamid, NaCl • Förbehandling: - avmaskering av DNA - blockering av ospecifik inbindning

More Related