동물실험계획서 작성법

1. 동물실험계획서 작성법 삼성생명과학연구소 실험동물연구센터 남미현

2. IACUC 동물실험계획서 PAM

5. Principles of humane experimental technique. 1959, Russell & Burch. “3R” Replacement Reduction Refinement

8. IACUC

9. IACUC →통합 위원회

10. Institutional Animal Care and Use Committee

14. “ 심의 위원 중에 일반인(비과학자)이 있음을 고려하시어, 쉬운 용어를 사용하여 내용 작성하여 주십시오. 특히, 전문 용어나 약어는 최초 사용시에 간략한 설명 혹은 full name을 기술하여 주시면 위원들의 이해도를 높이는데 도움이 되겠습니다. “

16. [ 심의절차 ]

17. 간사 administrative secretary / assistant administrator

18. 동물실험계획서

19. 동물실험계획서 Animal Care and Use Protocols ≠ Research Project 연구과제

20. 제 목 Project [ 물질 A의 품질 확인을 위한 연구] Protocol [ 급성 간부전 돼지 모델 제작 및 물질 A의 간 세포 보호 기전 연구]

21. 실험동물? 「동 물 보 호 법」 : 실험에 이용되는 척추 동물 중 포유류와 조류 「 실험동물에 관한 법률」 동물 실험을 목적으로 사용 또는 사육되는 척추 동물 마우스, 랫드, 기니피그, 햄프터, 저빌, 토끼, 개, 돼지, 원숭이

22. ALIVE

23. ※ 해당 계획서는 사전에 연구자로부터 교육 목적으로 활용 가능하다는 동의를 받았습니다.

24. 실험 목적 약물 A가 in vitro에서 대장암 세포의 증식을 억제함을 이미 확인하였으며,  in vivo에서도 종양의 성장을 억제하는지와 종양의 성장과 전이에 필요한  신혈관형성(angiogenesis)을 억제하는지 알아보고자 한다.  1.  약물 A 가 종양의 성장을 억제할 수 있는가?2.  약물 A 가 신혈관형성(angiogenesis) 억제할 수 있는가?3.  약물 A 를 같이 사용할 경우, 신혈관형성 억제제인 avastin의 저항성을 극복할 수 있는가? 

25. 가설 1.  약물 A 가 대장암 세포의 증식을 억제하여 종양의 성장도 억제할 것이다.2.  약물 A 가 종양의 성장을 억제하는데 종양의 성장에 필요한 신혈관형성(angiogenesis)도 억제될 것이다.3.  약물 A 을 같이 사용할 경우 신혈관형성 억제제인 Avastin의 효과를 향상시킬 것이다.4.  약물 A 을 같이 사용할 경우 신혈관형성 억제제인 Avastin에 대해 저항성을 나타내는 암세포도 종양 성장이 억제될 것이다.

26. 가 설 "A(실험동물)에게 B(물질 혹은 치료법)를 처치하면 처치하지 않은 경우에 비해 C(측정 데이터)가 어떠할 것으로 예상된다."

27. 실험 방법 1. 종양성장 억제 효과 확인 (종양 내 혈관생성이 억제되었는지 확인하기 위한 실험) 1) 마우스의 옆구리에 3X10^6개의 대장암 세포를 PBS 0.1ml에 준비하고(즉, 3X10^7 cells/1ml PBS의 세포를 0.1ml씩 주사) 피하 주사하여 이식한다. 2) 종양의 발생이 관찰되면(caliper로 측정시 약 3~5mm), 마우스를 4그룹으로 나누어 약물을 투여한다.그룹 1 -약물을 투여하지 않는 대조군 그룹 2 - 약물 A  2mg/kg, 7회/주 구강 투여그룹 3 - avastin 2.5mg/kg, 1회/주 복강 투여그룹 4 - 약물 A  2mg/kg, 7회/주 구강 투여+avastin 2.5mg/kg, 1회/주 복강 투여 3) 그룹1 대조군의 종양의 크기가 15X15mm 정도될 때까지(이전 실험의 경우 15~20일 정도) 3회/주 간격으로 종양의 크기를 측정하여 비교하고 실험을 종료한다. 4) 실험종료 후, CO2로 안락사 시키고 종양 sample을 채취하여 block으로 제작한다.

28. 실험 방법 2. Matrigel plug assay (angiogenesis 초기에 혈관생성 억제를 확인하기 위한 실험) 1) 마우스의 옆구리에 3X10^6개의 대장암 세포를 PBS 0.05ml에 준비한 후 matrigel 0.5ml과 섞어서(총 0.55ml) 피하 주사한다. 2) 다음날부터, 마우스를 4그룹으로 나누어 약물을 7일간 투여한다.그룹 1 - 약물을 투여하지 않는 대조군 그룹 2 - 약물 A  2mg/kg, 7회/주 구강 투여그룹 3 - avastin 2.5mg/kg, 1회/주 복강 투여그룹 4 - 약물 A  2mg/kg, 7회/주 구강 투여+avastin 2.5mg/kg, 1회/주 복강 투여 3) 7일 후, 마우스를 CO2로 안락사 시키고 matrigel을 채취하여 block으로 제작한다.

30. 자료 분석 내용 및 통계 분석 방법 연구의 가설은  1. 약물 A 투여 후 대장암 세포의 종양 성장속도 비교 : 약물투여 2~3주 후 종양의 크기에 차이가 있을 것이고, 약물 A 을 Avastin과 같이 투여한 경우 효과가 더 좋을 것이다. 2. 약물 A 투여 후 종양 내 신혈관형성(angiogenesis) 정도 비교 : 약물투여 2~3주 후 종양 내 종양 내 신혈관형성에 차이가 있을 것이고,  약물 A 을 Avastin과 같이 투여한 경우 효과가 더 좋을 것이다. 3.  약물 A 을 같이 사용할 경우, 신혈관형성 억제제인 avastin의 저항성을 나타내는 대장암 세포에서도 효과가 나타나리라 기대한다.한 set의 실험은 대조군과 실험군(약물 A 단독 투여, avastin단독 투여,  약물 A 와 avastin복합투여) 4조로 구성되고, 종양 크기의 차이가 최소한 50％ 이상을 의미 있다고 하고 종양의 표준편차가 30％ 일 때 유의수준 5％, 검정력80％ 하에서 각 군당 12마리의 동물이 필요하다. 모든 수치는 12마리의 평균±표준편차로 표시하고, 대조군과실험군과의 비교는 t-test와 Mann-Whitney U test로 검정하며 p<0.05일 때 유의성이 있다고 판단한다.

31. 사용 동물 수에 관한 근거 1.  약물 A 이 종양의 성장과 신혈관형성(angiogenesis)을 억제 비교대조군과 실험군의 종양 크기의 차이가 최소한 50％ 이상을 의미 있다고 하고 종양의 표준편차가 30％ 일 때 유의수준 5％, 검정력80％ 하에서 각 군당 12마리의 동물이 필요하므로 1set의 실험에 48마리의 동물이 필요하다. Avastin에 대해 저항성을 나타내는 세포주와 민감한 세포주, 총 세 종류의 세포를 사용하여 실험할 예정이므로 총 144마리의 마우스가 필요하다. 2. Matrigel plug assayangiogenesis 초기에 혈관생성 억제를 확인하기 위해서는 각 군 당 3마리의 동물에 약물을 투여하여 비교할 예정이므로 (이 부분은 pilot study이므로 반복 확인을 위해 3마리만 사용할 예정입니다.) 1 set에 12마리의 동물이 필요하다. 역시 Avastin에 대해 저항성을 나타내는 세포주와 민감한 세포주, 총 세 종류의 세포를 사용하여 실험할 예정이므로 총 36마리의 마우스가 필요하다. 이 두 가지 실험을 위해 총 180마리의 마우스가 필요하다.

32. PAM

33. PAM Post Approval Monitoring 승인후 점검

34. 동물 실험 계획 변경

35. 동물 실험 현황 「실험동물에 관한 법률 시행 규칙」 별지 제 15호 서식

36. 종료 보고서 「실험동물에 관한 법률 시행 규칙」 별지 제 7호 서식

39. IACUC Protocol PAM

40. - THE END -