补充一、分子发光分析技术 Molecular luminescence-fluorescence

补充一、分子发光分析技术Molecular luminescence-fluorescence

本章目录 16.1 分子发光分析概述 16.2 荧光和磷光分析基本原理 16.3 荧光和磷光分析法的特点与应用 16.4 化学发光分析

基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光（Molecular Luminescence）。在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。荧光—荧光分析法磷光—磷光分析法光致发光：以光源来激发而发光热致发光: 电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法生物发光：以生物体释放的能量激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法

16.2 荧光和磷光分析基本原理 一、背景知识大多数分子含有偶数电子，根据Pauli 不相容原理，每个轨道上最多容纳2个自旋方向相反的电子，即ms = +1/2或 – 1/2，同一轨道上两电子自旋量子数的代数和S为零。电子激发态的多重度：M = 2S+1：当S＝0时，即M=2S＋1＝1，称为单重态当S＝1时，即M=2S＋1＝3，称为三重态大多数基态分子处于单重态，表示为S0（基态单重态） S1、 S2、S3分别代表第一、二、三激发单重态 T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态

激发态 基态基态单重态S0激发单重态 S1激发三重态 T1 当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁：自旋平行注： 1、由基态→激发单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0，单重态有抗磁性； 2、由基态→激发三重态，电子自旋方向发生改变，净自旋  0，三重态有顺磁性。这种S0 → T1的跃迁为禁阻跃迁。 3、多数分子含有偶数电子，分子的电子基态多为单重态；没有基态三重态。 4、E (S1)>E (T1)。

二、荧光与磷光的产生 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量：传递途径辐射跃迁无辐射跃迁荧光F 磷光P 振动弛豫VR 内转移ic 体系间窜跃isc

T1 S1 S0 l1 l2 1、振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR)：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12-10-14s。 S2 特点：无辐射；速率快

S2 T1 S1 S0 l2 l1 2、内转移(Internal Conversion, IC)：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁。

内转移的特点 （1）无辐射；（2）内转化的速率取决于能级差：（3）分子无论被激发到哪一个电子激发态，在10-13～10-11 s内经内转移和振动弛豫都会跃迁到第一（最低）电子激发态的最低振动能级；相邻单重激发态能级接近，其振动能级常重叠，内转化的速率快； S1→ S0 因能量差大，内转化的速率慢，寿命长。

S2 T1 S1 荧光发射 S0 l3 l1 l2 3、荧光(Fluorescence)：处于第一激发单重态的最低振动能级的分子以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级(S1→ S0跃迁)时，产生荧光。

荧光的特点： （1）无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射跃迁到S1的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。  荧 > 激（2）荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭。

S2 系间窜跃 T1 S1 S0 l4 l1 l2 4、系间窜跃(Intersystem Conversion, ISC )：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁S1 （最低振动能级）→ T1（较高振动能级）跃迁。经振动弛豫，跃迁至第一电子激发态的最低振动能级。

S2 T1 S1 磷光发射 S0 l4 l1 l2 5、磷光发射(Phosphorescence)：当受激电子降到S1的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到T1振动能级，经振动驰豫到 T1最低振动能级，从T1最低振动能级回到基态能级所发射的光叫磷光（ T1→S0跃迁）。 ISC

T1 S1 S0 l1 l2 磷光特点：（1）由于改变电子自旋属禁阻跃迁，因而跃迁速率慢，持续时间长10-4～10s；光照停止后，可持续一段时间。（2）从T1也有回到S1，然后S1到S0发出荧光，叫延迟荧光。 S2 延迟荧光 l3

6、外转移(External Conversion, EC)：指受激分子与溶剂或其它分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消失的过程（熄灭或淬灭quenching）。

辐射能量传递过程荧光:第一激发单重态S1→基态S0磷光:第一激发三重态T1→基态S0辐射能量传递过程荧光:第一激发单重态S1→基态S0磷光:第一激发三重态T1→基态S0 非辐射能量传递过程振动弛豫内转换外转换系间窜越荧光和磷光的比较： 1）T1的能量低于S1，因此磷光辐射的波长比荧光更长。 2）三重态T1向基态S0的跃迁属于自旋禁阻，跃迁速率小，使之稳定性大，因而磷光（寿命10-6～10 -9s），比荧光（寿命10-4～10s）有长得多的寿命。 3）激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大，因此荧光比磷光发光强度相对大。

内转换 内转换振动弛豫 S2 系间窜越 S1 T2 T1 能量发射荧光发射磷光外转换吸收振动弛豫 S0 l4 l3 l 1 l 2

三、荧光效率及其影响因素 1、荧光效率：物质吸收了紫外可见光后，跃迁至激发态，激发态分子是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁，决定了物质能否发荧光。定义：发荧光的分子数目与激发态分子总数的比值。即：发荧光的分子数激发态分子总数荧光效率φf= 以各种跃迁的速率常数表示： kf —荧光发射过程的速率常数；主要取决于分子结构 ∑ki — 非辐射跃迁过程的速率常数之和，主要取决于化学环境，也与化学结构有关。  f是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，  f越大，荧光越强，在0~1之间。

分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构,才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。

2、荧（磷）光与分子结构的关系 (1) 跃迁类型大多数荧光物质首先吸收紫外可见光，产生  *，n  *跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生*  ， *  n跃迁产生荧光。   *与n  *跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103倍，寿命短。   *跃迁常产生较强的荧光， n  *跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。

Ff: 0.29；λf：310 nm Ff: 0.46；λf：400 nm (2) 共轭双键体系——有较强的荧光分子中必须含有共轭双键；共轭体系越大， p电子的离域性越强，越易被激发而生荧光（荧光效率高）且荧光峰向长波方向移动。芳香族化合物易产生荧光，注意：能够发荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。

再如： Ff: 0.28 Ff: 0.68 共轭体系增加，荧光效率增大！

Fluorene（芴） Ff: 1.0 Ff: 0.20 (3)荧光物质的刚性和共平面性增加，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小（即外转移能量损失减小），有利于荧光发射。例1：

例2 荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质

红色荧光 滂铬BBR，无荧光例3： 25

立体异构现象 顺式：非平面构型非荧光体反式：平面构型强荧光体

(4)取代基效应 ——取代基对物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类： a. 增强荧光的取代基 —— 有 -OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等给电子基团。由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与苯环上的  轨道平行，共享了共轭  电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。

b. 减弱荧光的取代基 —— -COOH 、 -NO2、-COOR 、-NO、-SH 吸电子基团，使荧光波长短移，荧光强度减弱芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。 c. 影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、SO3H等 d. 取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱。

(5) 金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定。不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光。例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+— Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强

3、环境因素对荧光的影响 (1) 溶剂的极性：电子激发态比基态的极性大，溶剂的极性增强，对激发态会产生更大稳定作用，使荧光强度增大，荧光波长红移。巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率

(2) 温度：温度升高，辐射跃迁的速率常数Kf基本不变，但非辐射跃迁的速率常数增大，故荧光效率降低。对磷光影响更大。 (3) pH值：含酸性或碱性取代基的化合物荧光性质受pH的影响。如：蓝色荧光无荧光 pH的影响也体现为对发光体的电子构型的影响。

再如： 无荧光蓝色荧光

(4) 表面活性剂：使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁几率，提高荧光效率。 (5) O2的存在：O2为顺磁性分子，溶液中溶解氧的存在，使激发单重态分子向三重态的系间窜跃速率加大，导致荧光效率降低，甚至熄灭。其它顺磁性物质也有这种作用。

4、磷光强度影响因素 (1) 随着温度的降低分子热运动速率减慢，磷光逐渐增强 (2) 重原子效应可以提高磷光物质的磷光强度 (3) 室温磷光当向溶液中加入适当的表面活性剂时，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境，增强了定向约束力，从而减少了磷光分子与溶剂分子的碰撞概率，增加了三重态的稳定性，导致磷光强度显著增大，称此为胶束增稳室温磷光。当磷光物质吸附于某些固体表面时，分子的刚性增加，三重态的碰撞去活化概率大大减小，也可在室温下产生较强的磷光，由此又产生了固体表面室温磷光分析法。

四、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系 相应的吸光分数为：吸收光强度 Ia = 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：

对于稀溶液，当 bc<0.05（磷光 bc<0.01）时： IF----荧光强度 φf-----荧光效率 b--吸收光程 --摩尔吸光系数 C--荧光物质浓度 IP----磷光强度 P-----磷光效率 k--与仪器灵敏度有关的参数 I0--入射光强度实验条件固定时磷光定量分析依据荧光定量分析依据

If C 注：高浓度时，IF ＝ KC不成立原因：（1）高次项（2）猝灭效应

荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光猝灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光猝灭剂。前面提到的氧分子及重原子效应都是常见的荧光猝灭剂。荧光自猝灭效应：由荧光物质自身引发的荧光强度减弱的现象叫荧光自猝灭效应常见的自猝灭现象有两种：一是当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。另一种是由于激发态分子之间的碰撞，导致非辐射跃迁概率的增大，荧光效率降低。

五、激发光谱与荧光（磷光）光谱 照射光波长如何选择？ 1.荧光的激发光谱曲线以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强处测量荧光强度，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制的关系曲线。与吸收光谱曲线形状类似。 2.荧光发射光谱固定激发光波长(选最大激发波长)和强度，化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线。

3. 激发光谱与发射光谱的关系 (1) Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，这是由于振动弛豫消耗了部分能量。 (2) 发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。

1→4 1→3 1→2 1→1 ex =290nm (MAX) (3)镜像规则通常荧光发射光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。固定em=620nm(MAX) 固定ex=290nm (MAX) 1→ 1 1→ 2 1→ 4 3 em= 620nm(MAX)

为什么成对称关系? 激发光谱：分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能级所致，形状取决于第一电子激发态的各振动能级的分布；发射光谱：由激发态分子的第一电子激发态的最低振动能级回到基态不同振动能级所致，形状取决于基态各振动能级的分布。因为基态和第一激发态的各振动能级分布极为相似,所以成镜像对称关系。

激发单色器光源样品池发射单色器数据处理仪器控制检测器一、荧光分析法 • 1、仪器设备 • 与分光光度计的主要差别： • 采用垂直测量方式，即在激发光相垂直的方向测量荧光，以消去透射光影响。 • 有两个单色器，一个置于液槽前，用于获得单色性较好的激发光；一个置于液槽后，用于分出某一波长的荧光，消除其他杂散光干扰。

(1) 光源 光源的要求：比吸收测量中的光源有更大的发射强度。常用荧光分析光源：氙灯，高压汞灯。氙灯光源：波长范围：250~800 nm连续光谱。是应用最广泛的光源。高压汞灯光源：光谱略呈带状，荧光分析中常用 365，405，436 nm三条谱线。 (2) 单色器：平面衍射光栅。 (3) 检测器：光电倍增管。

2、特点 优点：1）灵敏度高，比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级。（紫外吸收测的是吸光度，是透射光与入射光的比值；入射光强度增加透射光强度也增加） 2）选择性强，既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱定性；提供信息丰富如激发/发射光谱、荧光强度、荧光效率、寿命等参数反应分子的各种特性。 3）试样用量少。缺点：应用范围相对小（本身能发光的物质不多，增强荧光的方法也有限）。

3、应用 (1)无机化合物的分析 ①利用无机离子与一些有机化合物形成有荧光的络合物，对其进行荧光检测。目前采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70种。能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。荧光分析中常用的另一类络合物是三元离子络合物。 ②荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。 (2)有机化合物的分析 ①脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发生荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。 ②芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。 (3)生命与生物物质的分析

二、磷光光分析法 1、仪器设备与荧光分析仪器相似，也是由光源、单色器、液槽、检测器和信号显示记录器五部分组成。磷光特殊配件： 1）试样室：如将样品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。 2）磷光镜：一种机械切光装置，利用荧光和磷光寿命的差异消除荧光干扰。 2、磷光分析法应用主要用于测定有机化合物： 1）稠（杂）环芳烃分析 2）农药、生物碱、植物生长激素的分析 3）药物分析和临床分析

荧光棒 一、概述化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射称为化学发光，根据化学发光强度或化学反应产生的总发光强度来确定物质含量的方法称为化学发光分析法。化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同化学发光：需要化学反应过程中所提供的化学能激发而发光荧光：光源激发而发光

二、基本原理 化学发光的条件在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A + B → C + D* D* → D + h 化学发光必须具备以下条件： (1) 能快速的释放出足够的能量 (2) 反应途径有利于激发态产物的形成 (3) 激发态分子能够以辐射跃迁的形式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其他分子化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。

补充一、分子发光分析技术 Molecular luminescence-fluorescence