Prof. Neri Rolando

1. Le biotenologie Prima parte LICEO STATALE «Antonio Meucci» Prof. Neri Rolando

2. Cosa sono le biotecnologie? Le biotecnologie sono tutte quelle tecniche utilizzate (fin dall’antichità) per produrre sostanze specifiche a partire da organismi viventi o da loro derivati. A metà del Novecento la biologia molecolare offre gli strumenti per lo sviluppo dell’ingegneria genetica. Ceppo di batteri E. coli che produce insulina

3. DEFINIZIONE DI BIOTECNOLOGIA EuropeanFederationofBiotechnology «l’integrazione delle scienze naturali, e inoltre di organismi, cellule, loro parti o analoghi molecolari, nei processi industriali per la produzione di beni e di servizi» “l'utilizzazione di esseri viventi al fine di ottenere beni o servizi” Microrganismi, piante o cellule animali vengono utilizzate come fabbriche grazie alla tecnologia del DNA ricombinante Biotecnologie tradizionali e Biotecnologie moderne

4. INGEGNERIA GENETICA Produzione di nuove combinazioni di materiale ereditabile ottenute tramite inserzione di molecole di acido nucleico (DNA) di qualunque provenienza in un organismo ospite nel quale tali molecole di DNA non sono presenti OGM microorganismo o organismo il cui materiale genetico e’ stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura mediante incrocio o ricombinazione genetica

5. Applicazioni della tecnologia delDNA ricombinante • Creazione di organismi transgenici (ad es. il «goldenrice») • Produzione di proteine di interesse umano da parte dei microrganismi (ad es.: HGH) • Analisi della funzione dei geni attraverso la clonazione genica (ad es.: una volta effettuato il sequenziamento del DNA di una specie è necessario sapere la funzione svolta dai diversi geni) • Mappatura del genoma (ad es.: il sequenziamento del DNA umano) • Produzione a basso costo di vaccini più innocui • Terapia genica (ad es., nell’uomo l’obiettivo è quello di curare le malattie genetiche modificando i geni che ne sono la causa)

6. La tecnologia del DNA ricombinante Prima di procedere alla manipolazione genetica, è necessario purificare il materiale che deve essere trasformato in DNA ricombinante. In primo luogo, quindi, il DNA viene purificato, ossia separato da tutte le altre componenti cellulari. Nel corso della purificazione tutto ciò che non è DNA viene rimosso. Nelle diapositive successive vedremo in sintesi gli strumenti e i metodi che vengono usati per ottenere DNA ricombinante, ovvero come due o più tratti di DNA vengano uniti assieme dall’uomo in una sequenza che non esiste in natura.

7. La tecnologia del DNA ricombinante Materiali e metodi utilizzati • Enzimi di restrizione • Vettori • La reazione a catena della polimerasi (PCR)

8. La tecnologia del DNA ricombinante Uno strumento biotecnologico: gli enzimi di restrizione • Questa tecnica permette di tagliare piccole sequenze di DNA per trasferirle in genomi di altre cellule. • Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA a livello di specifiche sequenze chiamate siti di restrizione. • I frammenti di Dna prodotti da questi enzimi, generalmente, sono dotati di estremità coesive (sticky ends): brevi sequenze di nucleotidi spaiati, che possono aderire a sequenze complementari) • Le DNA ligasi cuciono i frammenti formando DNA ricombinante. In natura i batteri usano questi enzimi per tagliare a pezzi, e di conseguenza disattivare, le molecole di DNA estraneo, come quelle dei virus che attaccano le cellule batteriche

9. Gli enzimi di restrizione in azione 1 – Un filamento di DNA contiene una sequenza di riconoscimento 2 – Taglio: Un enzima di restrizione che riconosce tale sequenza procede lungo il DNA finché non arriva a essa. A quel punto taglia tutti e due i filamenti tra i due nucleotidi adiacenti che recano la base azotata G 3 – Frammento con estremità coesive Un’altra molecola dello stesso enzima di restrizione fa un secondo taglio in corrispondenza di un altro punto del DNA che presenta la stessa sequenza: si forma così un frammento di DNA. 4 – Associazione dei frammenti per complementarietà: La sequenza sporgente AATTC può facilmente aderire a qualsiasi tratto di DNA che presenti la sequenza sporgente TTAAG DNA ricombinante 5 – Formazione di una molecola circolare (plasmide) 6 – Dna ligasi: salda lateralmente i frammenti inseriti

10. Esempi di enzimi di restrizione Sono stati finora individuati oltre 1000 enzimi di restrizione che tagliano il DNA in centinaia di punti differenti, per cui i biotecnologi possono tagliare il DNA in molti modi differenti.

11. La tecnologia del DNA ricombinante Un altro strumento biotecnologico: i vettori Per trasportare il DNA ricombinante all’interno di una cellula ospite si usano vettori che possono essere plasmidi, virus o cromosomi artificiali di lievito.

12. VETTORI Proprietà e caratteristiche • AUTOREPLICAZIONE (duplicarsi in modo indipendente nella cellula dell’ospite) • DIMENSIONI TALI DA POTERE ESSERE MANIPOLATI ALL’ESTERNO DELLA CELLULA (dimensioni minori dei cromosomi dell’ospite) • PRESENZA DI MARCATORI GENETICI PER RILEVARNE LA PRESENZA (geni reporter per la resistenza a specifici antibiotici) • Possesso di una SEQUENZA DI RICONOSCIMENTO per un enzima di restrizione che lo possa tagliare e combinare con il nuovo DNA Principali vettori utilizzati: PLASMIDI, FAGO LAMBDA

13. L’esperimento di Cohen e Boyer Nel 1973 Cohen e Boyer combinano due sequenze diverse di DNA per produrre una nuova molecola di DNA ricombinante. Questo esperimento rappresenta l’inizio della tecnologia del DNA ricombinante. Problema: Come inserire i plasmidi nelle cellule, in questo caso, di E. coli? Lo vedremo nelle prossime diapositive.

14. INSERIMENTO DI DNA ESOGENO NELLE CELLULE Si ricorre al processo di TRASFORMAZIONE • Bisogna rendere competenti le cellule ospiti: • Trattamento con cloruro di calcio e shock termico • Elettroporazione • Fusione di protoplasti (cellule vegetali) • Microiniezione (cellule animali)

15. INSERIMENTO DI DNA ESOGENO NELLE CELLULE Nella trasformazione la cellula donatrice libera molecole di DNA che racchiudono la sua informazione genetica (in questo caso un plasmide ricombinante) e alcune delle molecole vengono assunte dalla cellula ricevente (in questo caso il batterio Escherichia coli). Alcune cellule batteriche sono «esperte»in questo processo, mentre altre, possono essere indotte a effettuarlo con opportuni trattamenti chimici.

17. INSERIMENTO DI DNA ESOGENO NELLE CELLULE Per inserire il DNA esogeno si può ricorrere anche alla coniugazione Tuttavia, non tutti i batteri hanno la capacità di costruire i pili sessuali e il tubo di coniugazione. Per poterlo fare infatti devono possedere specifici geni che normalmente non sono presenti nel cromosoma batterico. Tali geni si trovano su una piccola molecola di DNA chiamata plasmide F, presente nei batteri donatori. Talvolta il plasmide F è integrato nel Dna della cellula ospite (Hfr); ed allora, in questo caso, la coniugazione, che prevede il passaggio di plasmidi, assomiglia alla trasduzione specializzata perché i vettori portano con sé i geni che si trovano adiacenti al loro punto di inserimento sul cromosoma ospite.

18. INSERIMENTO DI DNA ESOGENO NELLE CELLULE Per inserire il DNA esogeno si può ricorrere anche alla trasduzione • Un virus batteriofago si può comportare da vettore e trasferire DNA da una cellula batterica a un’altra, processo noto come trasduzione. • l’utilizzo dei virus come vettori può essere più pericoloso, nel senso che c’è una minore capacità di controllo della loro attività, infatti potrebbero a un certo punto andare incontro a un ciclo litico indesiderato.

19. Amplificazione per clonazione Una volta introdotto il DNA ricombinante tramite un plasmide, come nella figura, otteniamo quello che viene detto «organismo geneticamente modificato» o OGM. Una volta all’interno di una cellula batterica, un plasmide ricombinante può replicarsi anche in decine di copie (clonazione genica). Ogni volta poi che le cellule batteriche si duplicano (clonazione cellulare), lo fanno anche i plasmidi.

20. Come ottenere i geni di interesse Le principali fonti da cui provengono i frammenti di DNA utilizzati nelle procedure di clonazione sono tre: • Librerie geniche contenenti copie naturali dei geni • Librerie geniche contenenti copie a cDNA dei geni ottenuti a partire dall’mRNA • DNA sintetico. La sequenza del gene deve essere nota prima di procedere alla sintesi

21. Librerie geniche Come si procede: • Occorre estrarre il DNA dall’organismo di interesse • Digerire il DNA con gli enzimi di restrizione • I frammenti vengono «ligati»a dei vettori (plasmidi o fagi) • I vettori vengono introdotti nelle cellule batteriche • in questo modo si ottengono ceppi diversi di batteri ricombinanti • Le cellule batteriche vengono fatte riprodurre in opportuni terreni di coltura • Si otterrà una collezione di cloni che conterranno i vari geni di interesse. Questa collezione di cloni è la LIBRERIA GENICA

22. Le genoteche di frammenti di DNA Quindi, dopo aver clonato il DNA ricombinante nelle cellule transgeniche secondo la procedura qui di lato rappresentata, queste colture cellulari diventano degli archivi (genoteche) di informazioni genetiche. RIMANE ORA UN ULTIMO PROBLEMA: come identificare il ceppo portatore del gene di interesse. Se è conosciuta almeno in parte la sequenza di basi azotate del gene, si può utilizzare una sonda radioattiva, costituita da una sequenza di nucleotidi o di ribonucleotidi, marcati radioattivamente, che sia complementare alla sequenza nota del gene.

23. Le biblioteche di cDNA Gli mRNA trascritti da una cellula in un particolare tessuto e in un particolare periodo del ciclo biologico di un organismo si possono copiare in sequenze complementari di DNA (cDNA). La sintesi di cDNA risulta particolarmente utile per l’identificazione di mRNA presente soltanto in poche copie, e costituisce spesso il punto di partenza per clonare un gene.