1 / 46

Outline

Outline. Gene Finding : Struttura ed identificazione di geni in procarioti ed eucarioti; Hidden Markov Models; Genscan;. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007. Gene Finding: Premessa.

jayme
Download Presentation

Outline

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Outline • Gene Finding: • Struttura ed identificazione di geni in procarioti ed eucarioti; • Hidden Markov Models; • Genscan; Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  2. Gene Finding: Premessa • Dimensione del genoma umano: 3 x 109 coppie di nucleotidi • Numero di geni ≈ 25.000 • Percentuale di DNA codificante ≈ 1.6% Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  3. Gene Finding: Cosa e’? • Data una sequenza di DNA non caratterizzata, trovare: • Quali regioni che codificano per proteine • Quale dei due filamenti della doppia elica di DNA è codificante • Quale schema di lettura è usata in quest’ultimo • Dove comincia e dove finisce il gene • Dove sono i confini tra esoni/introni negli eucarioti • Etc Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  4. Filamento antisense: TCAAGCGTAAGCCAT Gene Finding: Struttura del gene Schema di lettura: ogni segmento di DNA ha 6 schemi di lettura Filamentosense: ATGGCTTACGCTTGA Reading frame #3 GGC TTA CGC TTG A.. Reading frame #1 ATG GCT TAC GCT TGC Reading frame #2 TGG CTT ACG CTT GA. Reading frame #5 CAA GCG TAA GCC AT. Reading frame #6 AAG CGT AAG CCA T.. Reading frame #4 TCA AGC GTA AGC CAT Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  5. Un gene continuo Un gene discontinuo (esoni intervallati da introni) Gene dentro un introne di un altro gene Geni sovrapposti Gene Finding: Organizzazione del gene Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  6. Gene Finding: Struttura del gene procariotico GENE 5’ 3’ ATGCTACGGATG……..TGA Regione Regolatrice Promotore Segnale di Start Segnale di Stop Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  7. Gene Finding: Struttura del gene Eucariotico Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  8. start stop ORF Gene Finding: ORF (Open Reading Frame) Un ORF o schema di lettura aperto è una zona compresa tra 2 segnali, uno di start e uno di stop presenti nello stesso frame. All’interno dell’ORF non sono presenti ulteriori segnali di Stop. Un ORF è una potenziale regione codificante per proteine. ATG segnali di stop: TAA, TGA e TAG Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  9. Gene Finding: Primo passo • La distanza media tra due segnali di stop in una sequenza casuale di DNA è 64/3 ≈ 21 • Una proteina è lunga mediamente 300 aminoacidi • Se individuiamo due segnali di stop sufficientemente distanti tra loro potremmo essere in presenza di un potenziale gene Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  10. ORF ? Gene Finding: ORF in un gene procariotico Frame 1 Frame 2 Frame 3 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  11. Gene Finding: Algoritmo Per ogni frame bisogna: Calcolare la distanza tra ogni coppia di segnali di stop consecutivi. Se sono sufficientemente distanti, si va a ricercare il primo codone di start utile. Trovato un ORF di lunghezza sufficiente, è da considerare un potenziale gene. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  12. Gene Finding: ORF in un gene eucariotico • Quali delle finestre che vediamo sono esoni? • Quali invece sono assenze casuali di segnali di stop? Frame 1 Frame 2 Frame 3 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  13. Gene Finding: Procarioti vs Eucarioti Procarioti: • Piccoli genomi 0.5 – 10·106 bp • Alta densità basi codificanti (>90%) • No introni • Identificazione del gene relativamente semplice. Probabilità di successo ~ 99% Eucarioti: • Grandi genomi 107 – 1010 bp • Bassa densità basi codificanti (<50%) • Struttura introni/esoni • Identificazione del gene complessa, livello di accuratezza ~ 50% Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  14. Gene Finding: Metodo statistico • Un metodo migliore per determinare regioni codificanti tiene conto delle frequenze dei codoni • Un uso diverso dei codoni nella regione codificante è una caratteristica universale dei genomi • Uso diseguale degli aminoacidi nelle proteine esistenti • Uso diseguale di codoni sinonimi • Possiamo usare queste caratteristiche per differenziare regioni codificanti e non codificanti del genoma Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  15. Gene Finding: Segnali di codifica Distribuzione delle frequenze di coppie di aminoacidi nelle sequenze delle proteine(shewanella). La frequenza media è del 5%. Ogni amminoacido ha delle preferenze nel precedere o seguire un altro amminoacido. Alcuni aminoacidi sono molto più frequenti di altri. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  16. Gene Finding: Segnali di codifica La frequenza delle coppie di aminoacidi dipende dal genoma!!! shewanella bovino Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  17. Gene Finding: Segnali di codifica • Le preferenze degli aminoacidi si rispecchiano sulle coppie di codoni (o esanucleotidi) presenti nelle zone codificanti. Ad esempio Nel genoma umano la frequenza della sequenza “AAA AAA” è ~1% nelle regioni codificanti contro ~5% delle regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  18. Gene Finding: Segnali di codifica • Molti esanucleotidi mostrano grosse differenze di frequenza tra zone codificanti e non codificanti. • Fondamenti per rilevare regioni codificanti • La frequenza delle coppie di codoni sono segnali chiave usati per identificare regioni codificanti; Tutti i programmi di gene prediction se ne avvalgono. Regioni di DNA dove sono presenti moltissimi esanucleotidi che sono risultati frequenti in regioni codificanti già appurate, sono probabilmente regioni codificanti; al contrario sono regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  19. Gene Finding: Modello preferenziale • Per ogni esanucleotide X (es: AAA AAA), calcolare la sua frequenza in regioni codificanti (FC(X)) e non codificanti(FN(X)) • Calcolare il valore della preferenza di X: P(X) = log(FC(X)/FN(X)) Proprietà P(X) vale 0 se X ha la stessa frequenza sia nelle regioni codificanti, che in quelle non codificanti. P(X) ha un valore positivo, se X compare più spesso in regioni codificanti rispetto a quelle non codificanti; più grande è la differenza più alto sarà il valore di P(X). P(X) ha un valore negativo, se X ha frequenza maggiore in regioni non codificanti; più grande è la differenza più piccolo sarà il valore di P(X). Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  20. Gene Finding: Modello preferenziale Esempi AAA ATT e AAA GAC hanno le seguenti frequenze • FC(AAA ATT) = 1.4%, FN(AAA ATT) = 5.2% • FC(AAA GAC) = 1.9%, FN(AAA GAC) = 4.8% • Avremo • P(AAA ATT) = log (1.4/5.2) = -0.57 • P(AAA GAC) = log (1.9/4.8) = -0.40 • Una regione formata solo da esanucleotidi di questo tipo, è probabilmente una regione non codificante. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  21. Gene Finding: Modello preferenziale • Perché usiamo un modello basato su coppie di codoni ? • Modelli basati su singolo codone spesso non danno abbastanza informazione per capire se siamo davvero in una regione codificante o meno. • Modelli basati su triple di codoni hanno bisogno di moltissimi dati per rendere attendibile la statistica. 4*4*4 = 64 codoni 4*4*4*4*4*4 = 4,096 coppie di codoni 4*4*4*4*4*4*4*4*4= 262,144 triple di codoni Nel caso di triple di codoni avremo quindi necessità di avere almeno un numero elevatissimo di sequenze caratterizzate per popolare la matrice delle frequenze Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  22. Gene Finding: Predizione di una regione codificante Un semplice modello basato sulle frequenze dei codoni: • Sia fabc la frequenza con la quale il codone abc occorre in una regione codificante. • Data la coding sequence a1,b1,c1,a2,b2,c2,……,anbncn,an+1bn+1cn+1 la probabilità di osservare la sequenza di n codoni nei vari frame di lettura: p1 = fa1,b1,c1 x fa2,b2,c2 x … x fan,bn,cn p2 = fb1,c1,a2 x fb2,c2,a3 x … x fbn,cn,an+1 p3 = fc1,a2,b2 x fc2,a3,b3 x … x fcn,an+1,bn+1 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  23. Gene Finding: Predizione di una regione codificante • Denotiamo con Pi la probabilità dell’i-esimo frame di lettura come: • E’ possibile utilizzare in un algoritmo per la ricerca di regioni codificanti nel modo seguente: • Consideriamo finestre di size n e calcoliamo Pi per ogni punto di start; Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  24. Gene Finding: Predizione di una regione codificante • plot di log(p/(1-p)) per i tre frame di lettura: In questo frame di lettura il gene è chiaramente riconosciuto gene Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  25. Gene Finding: Soglia minima Regione codificante? Dove sono i confini ? • Decidiamo un valore di soglia per marcare una regione come codificante. Tale valore deve essere scelto testandolo su un training set. Deve essere tale da trovare il maggior numero di regioni codificanti ed escludere il maggior numero di regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  26. Gene Finding: Boundary Esoni/Introni Usando come training set, sequenze di DNA la cui suddivisione esoni/introni sia conosciuta, alliniamo tali sequenze rispetto ai due siti di splicing. Esone Introne Esone  --gaggcatcag|gtttgtagac-----------tgtgtttcag|tgcacccact-- --ccgccgctga|gtgagccgtg-----------tctattctag|gacgcgcggg-- --tgtgaattag|gtaagaggtt-----------atatctacag|atggagatca-- --ccatgaggag|gtgagtgcca-----------ttatttgcag|gtatgagacg-- Splice site Splice site EsoneIntroneEsone --gaggcatcag|GTttgtagac-----------tgtgtttcAG|tgcacccact-- --ccgccgctga|GTgagccgtg-----------tctattctAG|gacgcgcggg-- --tgtgaattag|GTaagaggtt-----------atatctacAG|atggagatca-- --ccatgaggag|GTgagtgcca-----------ttatttgcAG|gtatgagacg-- Splice site Splice site Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  27. Gene Finding: Segnali associati con gli estremi di una regione codificante • Entrambi i siti di splicing hanno particolari profili di distribuzione nell’uso dei nucleotidi Distribuzione dei nucleotidi attorno al Sito Accettore (Genoma Umano). Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  28. Gene Finding: Segnali associati con gli estremi di una regione codificante • Entrambi i siti di splicing hanno particolari profili di distribuzione nell’uso dei nucleotidi Distribuzione dei nucleotidi attorno al Sito Donatore (Genoma Umano). Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  29. Gene Finding: Procedura per identificare i segnali • Creare le matrici pesate per i siti donatori e accettori. • Sommiamo le frequenze delle lettere corrispondenti nelle posizioni corrispondenti …AAGGTAAGTGTCTCA… AAGGTAAGT:(34.0+60.4+80.3+100+100+52.6+71.3+81.4+46.2)/100= 6.262 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  30. Gene Finding: Procedura per identificare i segnali • Creare le matrici pesate per i siti donatori e accettori. • Sommiamo le frequenze delle lettere corrispondenti nelle posizioni corrispondenti …AAGGTAAGTGTCTCA… AGTGTCTCA:(34.0+12.5+ 7.3+100+100+ 2.8+ 9.3+ 5.5+16.0)/100= 2.874 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  31. Gene Finding: Identificare i segnali • In corrispondenza di un sito di splicing, la corrispondente funzione di score avrà un picco significativo. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  32. Gene Finding: Rappresentazione grafica della regione codificante di un gene eucariotico • Vengono scelti tra gli esoni predetti un insieme che non causa overlapping Frame 1 Frame 2 Frame 3 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  33. Gene Finding: Ulteriori segnali • Segnali che identificano la trascrizione • TATA-Box (25-30 basi prima dello start) presente nel 70% dei casi • sito di PolyA (AATAAA oppure ATTAAA) • Segnali che identificano i promotori Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  34. Gene Finding: Ulteriori dati statistici Distribuzione lunghezza esoni 150 bp Distribuzione lunghezza introni 60 bp Una regione ricca di G+C è indice della presenza di un gene (vale solo per i genomi degli eucarioti superiori) 50% G+C Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  35. Gene Finding: Modelli di Markov La probabilità di un evento dipende dagli eventi precedenti Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  36. Gene Finding: Probabilità di una sequenza di eventi • P(Sole, Pioggia, Pioggia, Pioggia, Neve, Neve) = P(Sole) P(Pioggia | Sole) P(Pioggia | Pioggia) P(Pioggia | Pioggia) P(Neve | Pioggia) P(Neve | Neve) Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  37. Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) Quale è la sequenza meteorologica più probabile che ha generato questa sequenza di azioni? Assunzione (First order Markov chains): La probabilità di un evento dipende solo dal precedente. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  38. Probabilità di transizione dalla regione I alla II con la sequenza TT Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) ESEMPIO Creiamo un modello per distinguere due regioni (per semplicità supponiamo siano presenti solo due nucleotidi) Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  39. Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) ESEMPIO A quale regione appartiene la sequenza TTAT ? • Calcoliamo la probabilità di tutte le possibili sequenze di nucleotidi appartenenti alle due regioni. Risulta più probabile che la sequenza appartiene integralmente alla regione I Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  40. Gene Finding: Genscan http://genes.mit.edu/GENSCAN.html • Il tool di gene prediction più utilizzato • Presenta il miglior compromesso tra Sensibilità e Specificità (sono due misure di accuratezza) • Largamente utilizzato dal Consorzio Internazionale durante il Progetto Genoma Umano • Utilizza come algoritmo di base l’ Hidden Markov Model (generalizzato) Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  41. Gene Finding: Genscan è basato su HMM http://genes.mit.edu/GENSCAN.html Le coppie di introni/esoni rappresentano i differenti modi in cui un introne può interrompere una coding sequence (dopo la 1° base, dopo la 2° o dopo la 3°) E0 E1 E2 I0 I1 I2 Einit Eterm Esone iniziale e finale 3’ UTR 5’ UTR Esngl polyA P Filamento sense N ………………….. ………………….. Filamento antisense Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  42. Gene Finding: Misura dell’accuratezza nella predizione • Scelta una caratteristica (es: identificazione esoni) Possiamo definire i seguenti valori • TP (true positive) = Numero di esoni predetti, che sono risultati veri esoni. • FP (false positive) = Numero di esoni predetti che sono in realtà dei falsi. • TN (true negative) = Numero di esoni falsi, identificati come tali. • FN (false negative)= Numero di esoni reali, identificati come falsi. Avremo le seguenti misure Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  43. Gene Finding: Confronto tra tool di gene predictioon (Parametri calcolati a livello nucleotidico) Coefficiente di correlazione Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  44. Gene Finding: Interfaccia Genscan Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  45. Probabilità che l’elemento sia un esone Inizio, Fine e lunghezza dell’ elemento calcolato Score del sito Accettore e Donatore di splicing Filamento sul quale viene fatta la predizione Score della coding sequence calcolata Numerazione del Gene e dei suoi elementi Frame del primo codone dell’elemento Score complessivo dell’esone Tipo di elemento riconosciuto Gene Finding: Output di Genscan Proteina predetta sulla base della CDS calcolata Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

  46. Gene Finding: Esempio di uso di GenScan Eseguire con Genscan la scansione del frammento di genoma di Homo sapiens >gi|2253431|gb|AF007546.1|AF007546 Utilizzare la proteina predetta da Genscan per fare un BLAST proteico (BLASTP) per vedere a cosa corrisponde la predizione fatta da Genscan. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

More Related