Εργαστηριακή διάγνωση της HIV λοίμωξης

1. Εργαστηριακή διάγνωση της HIV λοίμωξης ΛεμονιάΣκούρα Λέκτορας, Α Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Α.Π.Θ

2. Διάρθρωση της παρουσίασης • HIV, AIDS: βασικά χαρακτηριστικά ιού και συνδρόμου • μέθοδοι: βασικές αρχές-ερμηνεία αποτελεσμάτων- διαγνωστικά προβλήματα • σύγχρονοι προβληματισμοί στην εφαρμογή των μεθόδων • προτεινόμενες στρατηγικές εφαρμογής • στόχοι-προοπτικές • συμπεράσματα

3. HIV & AIDS (Ι) • 1981: πρώτη περιγραφή AIDS

4. HIV & AIDS (ΙΙ) • 1983/84 απομόνωση HIV-1 • 1986 απομόνωση HIV-2 Luc Montagnier Robert Gallo HIV-2 εμφανίζει 40% ομολογία νουκλεοτιδίων με τον HIV-1

6. Αναπαραγωγή του ιού…..

7. Αναπαραγωγή του ιού….. • Κύκλος ζωής ιού διαρκεί 2.6 ημέρες • 10 billion HIV σωματίδιαπαράγονται κάθε ημέρα • Μέση ζωή ιού στο πλάσμα είναι 6 ώρες

8. Πορεία HIV λοίμωξης

9. Εξέλιξη HIV λοίμωξης • παράγοντες ξενιστή • Πολυμορφισμοί γονιδίων μορίων φυσικής και ειδικής ανοσίας • Συνυποδοχείς HIV λοίμωξης • ιικό φορτίο viral “set point”

12. Κλινικές εκδηλώσειςΟξεία HIV λοίμωξη • πυρετός • κεφαλαλγία • κυνάγχη • εξάνθημα • γενικευμένη λεμφαδενοπάθεια

13. HIV λοίμωξη εργαστήριο διάγνωση της HIV λοίμωξης

14. Δείκτες- μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης HIV λοίμωξης • γενετικό υλικό του ιού Μοριακές τεχνικές • αντιγόνα του ιού Ορολογικές τεχνικές • αντισώματα του ξενιστή

15. Ιικοί δείκτες εργαστηριακής διάγνωσης HIV-1λοίμωξης HIV-1 gp120 Genomic RNA gp41 p17 p24 p66/51 P66/51

16. Eμφάνιση δεικτώνστην πορεία της HIV λοίμωξης Μοριακές τεχνικές

17. Ορολογικές μέθοδοι • Μέθοδοι προκαταρκτικού ελέγχου (screening) • Enzyme immunoassays (EIAs) • Chemiluminescent immunoassays (CLIAs) • Immunochromatography • Membrane immunoconcetration Ταχείες διαγνωστικές μέθοδοι • Επιβεβαιωτικές/συμπληρωματικές δοκιμασίες Μέθοδοι ανοσοαποτύπωσης • Western blot • Line immunoassays

18. Προκαταρκτικός έλεγχος • ELISA αντιγόνου-αντισώματος 4ης γενιάς • ταυτόχρονη ανίχνευση Ag & Αb (IgG & IgM) • ταυτόχρονη ανίχνευση αντισωμάτων έναντι HIV-1 & HIV-2 • ανίχνευση αντιγόνου p24 από την 16η ημέρα από τη μόλυνση

19. Βασική αρχή ELISA αντιγόνου-αντισώματος

20. Αποτελέσματα ELISA ΘΕΤΙΚΟ ΑΡΝΗΤΙΚΟ

21. ELISA: εκτίμηση-ερμηνεία αποτελεσμάτων Ψευδώς θετικά αποτελέσματα πολλαπλές μεταγγίσεις, αντισώματα HLA αντιγόνα υπεργαμμασφαιριναιμία, πρόσφατος εμβολιασμός, αιμοδιάλυση, αυτοανταντισώματα • Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα υπογαμμασφαιριναιμία, ανοσοκαταστολή διαγνωστικό παράθυρο, περιορισμοί «kit»

22. Ταχείες διαγνωστικές μέθοδοι

24. Ανάγνωση20-40 min

25. Ταχείες διαγνωστικές μέθοδοι: κλινικές εφαρμογές • Επαγγελματική έκθεση • Πριν από τον τοκετό-χωρίς έλεγχο κατά την κύηση • Ασθενείς υψηλού κινδύνου, που προσέρχονται στα επείγοντα με άγνωστο «HIV status»

26. Western blot (I) Ανίχνευση αντισωμάτων σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες HIV-1ή 2

27. Western blot (II) p17 p66/51

28. Αποτελέσματα WB θετικό αποτέλεσμα 2 από τα 3 αντιγόνα p24, gp41, gp 120/160 CDC, 1991

29. Ακαθόριστα (Indeterminate) αποτελέσματα με WΒ Αίτια μη ειδικές αντιδράσεις υπεργαμμασφαιριναιμία διασταυρούμενη αντίδραση (εγκυμοσύνη, HTLV I/II) λοίμωξη με HIV-2 αυτοάνοσα νοσήματα

30. Μοριακές μέθοδοι • PCR • ποιοτική • HIV-1 proviral DNA • HIV-1 DNA + RNA • HIV-2 RNA • ποσοτική • HIV-1 RNA • HIV-2 RNA • Transcription- • Mediated Amplification • ποιοτική • HIV-1 RNA • Branched DNA • (signal amplification) • ποσοτική • HIV-1 RNA

31. Μοριακές τεχνικές: εκτίμηση αποτελεσμάτων Ψευδώς θετικά αποτελέσματα • Επιμόλυνση • Μη ειδική υβριδοποίηση • Παροδική αύξηση ιικού φορτίου σε άλλες λοιμώξεις (HSV, λοιμώξεις αναπνευστικού) και εμβολιασμούς

32. Νεότερες μέθοδοι Real-time immuno PCR (IPCR) Am J Clin Pathol 2004

33. Σύγχρονοι προβληματισμοί στη διάγνωση της HIV λοίμωξης Διάρθρωση της παρουσίασης • μέθοδοι: βασικές αρχές-ερμηνεία αποτελεσμάτων- διαγνωστικά προβλήματα • σύγχρονοι προβληματισμοί στην εφαρμογή των μεθόδων • προτεινόμενες στρατηγικές εφαρμογής • στόχοι-προοπτικές • συμπεράσματα

34. Μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης HIV λοίμωξης Επιλογή μεθόδου εργαστηριακής διάγνωσης? • Ευαισθησία 99 % • Ειδικότητα 98 % GUIDANCE ON PROVIDER-INITIATED HIV TESTING AND COUNSELLING IN HEALTH FACILITIES, WHO 2007 Προτεινόμενοι αλγόριθμοι

35. Αλγόριθμος ορολογικού screening ELISA HIV1/2 &O - + AΡΝΗΤΙΚΟ HIV-1 WB + AMΦΙΒΟΛΟ - HIV-1 ΛΟΙΜΩΞΗ HIV-2 WB ΜΟΡΙΑΚΗ

36. Θετικά αποτελέσματα μεταχείες διαγνωστικές μεθόδους • επιβεβαίωση με WB • σε περίπτωση αμφίβολου ή αρνητικού αποτελέσματος επανάληψη σε 4 εβδομάδες από το αρχικό αποτέλεσμα

37. Ακαθόριστα (Indeterminate) αποτελέσματα με WΒ • επανάληψη σε 2-4 εβδομάδες σε υψηλού κινδύνου και 3 – 6 μήνες σε χαμηλού κινδύνου • HIV-1 RNA ή proviral DNA

38. Εφαρμογή των μοριακών τεχνικών • HIV-1 DNA : περιορισμένηδιαγνωστική χρησιμότητα στους ενήλικες • HIV-1 RNA : «επικουρικά» στα διαγνωστικά προβλήματα των ορολογικών μεθόδων • HIV-1 DNA & RNA : εργαστηριακή διάγνωση κάθετης μετάδοσης

39. Εργαστηριακή διάγνωσηκάθετης μετάδοσης • 2 δείγματα αίματος (dried blood spots) • 2 διαφορετικές ημερομηνίες • γέννηση • 4η-7η εβδομάδα • 8η-16η εβδομάδα King SM, Pediatrics 2004 εφαρμογή ποιοτικής HIV-1 DNA (PCR), HIV-RNA (TMA) ή ποσοτικής HIV-RNA (PCR)

40. Αποκλεισμόςκάθετης μετάδοσης HIV •  2 αρνητικές ιολογικές εξετάσεις • ηλικία  1 μήνα • ηλικία  4 μήνες •  2 αρνητικές εξετάσεις προσδιορισμού Abs σε ηλικία  6 μήνες

41. Έλεγχος HIV λοίμωξης: WHO συστάσεις εργαστηριακός έλεγχος ρουτίνας σε όλα τα άτομα (13-64 ετών) συγκατάθεση στο πλαίσιο του γενικού ελέγχου επανάληψη κάθε χρόνο σε άτομα υψηλού κινδύνου Revised recommendations for HIV testing of Adults, Adolescents, and Pregnant Women in Health-Care Settings. MMWR 2006 / 55(RR14);1-17

42. Έλεγχος HIV λοίμωξης στην εγκυμοσύνη: WHO συστάσεις εγκυμοσύνη εξέταση στο 1ο τρίμηνο επαναληπτικός έλεγχος στο δεύτερο τρίμηνο σε άτομα υψηλού κινδύνου Revised recommendations for HIV testing of Adults, Adolescents, and Pregnant Women in Health-Care Settings. MMWR 2006 / 55(RR14);1-17

43. Συμπεράσματα • πληθώρα διαγνωστικών μεθόδων εργαστηριακής διάγνωσης • επιλογή κατάλληλης μεθόδου • διεύρυνση προκαταρκτικού ελέγχου- εξέταση όλων των ατόμων τουλάχιστον μία φορά στη διάρκεια της ζωής τους

44. Ευχαριστώ