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해양미생물유래 세포외 다당류의 개발

Marine Microbial Diversity Lab. 해양미생물유래 세포외 다당류의 개발. 2002. 5. 2 한 국 해 양 연 구 원 이 홍 금. Marine Microbial Diversity Lab. 목 차. 서론 미생물 유래 다당류 해양미생물 유래 다당류 개발 사례 - 해양세균 (Bacteria) - 해양남조류 (Cyanobacteria) - 해양미세조류 (Microalgae). ( 단위 : 억 달러 ).

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해양미생물유래 세포외 다당류의 개발

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  1. MarineMicrobialDiversity Lab. 해양미생물유래 세포외 다당류의 개발 2002. 5. 2 한 국 해 양 연 구 원 이 홍 금

  2. MarineMicrobialDiversity Lab. 목 차 • 서론 • 미생물 유래 다당류 • 해양미생물 유래 다당류 개발 사례 - 해양세균 (Bacteria) - 해양남조류 (Cyanobacteria) - 해양미세조류 (Microalgae)

  3. (단위 : 억 달러) (산업자원부 21세기 한국 산업의 비젼과 발전 전략,’99) 국내외 생물 산업의 시장 규모

  4. 바이오 화학 국내 생산규모 (단위:백만원)

  5. 환경소재 • 응집활성제 • 중금속 흡착제 • 산업소재 • 연마제 • 세라믹제 • 콘크리트 혼합제 • 의약품 • 항암제 • 항생제 • 의약운반제 • 화장품제 • 유화안정제 • 보습제 • 윤활제 • 식품첨가제 • 기능성 보조식품 • 유화 안정제 • 젤 형성제 바이오 폴리머 (EPS)

  6. 해조 유래 다당류 • 한천(agar), 알긴산(alginase), 카라기난(carageenan) • 1997년의 천연 겔화 다당류의 세계 시장 규모 - 10억불 • 이중 45%가 해양유래 카라기난, 한천, 알긴산.

  7. 알긴산 (Algainic acid)

  8. 알긴산의 화학구조 Poly-β-D-Mannuronate Poly-α-L-Guluronate Poly-β-D-Mannuronate과 Poly-α-L-Guluronate

  9. 알긴산 생산 비율

  10. 알긴산의 용도 • 점액을 증가하는 증점제 - 세발제, 로션, 크림, 치약, 연고 등에 사용 • 보호콜로이드성, 포말 안정성, 보형성, 피막 형성성, 이장방지작용, 응교성, 결정석출 방지작용, 응집침강촉진 효과

  11. 카라기난 (Carageenan)

  12. 카라기난의 화학구조 mu-carrageenan Kappa-carrageenan AFM image (1m X 1m)

  13. 카라기난 생산 비율

  14. 카라기난의 용도 • 세계 연간 14,000톤 소비 • 일본 - 연간 200톤 화장품원료로 사용 • 일본 - 연간 150톤 방향제로 소비 • 전 세계 생산 46% - 필리핀 양식 Eucheuma cottomii로 충당

  15. 물질명 가격($/Kg) 물질명 가격($/Kg) Agar (food-grade) 15 Fucoidan 10 Agar (bacterial-grade) 100-200 mineral 류 20 Agar (electrophoresis) 400 Amino acid 50 Carageenan 5-20 지방산 10 (food additives) Chlorophyll 100 Sterin 100 Polyphenol 10 Glycerine 5 Carotenoid 50 Choline 480 EPA 4,000 Vitamine B12 57,000 Fucotirol 400,000 Bioadhesive 15,000,000 Phycobiliprotein 75,000,000 해양생물에서 생산되는 산업용 생물소재

  16. 미생물 다당류 개발의 장점 기존 다당류 대체한 신규성 환경에 따른 천연 다당류 공급 변동 원료 확보 및 높은정제 비용 미생물 다양성 유전자 재조합 가능 수식에 의한 용도개발 인공대량배양가능 가능한 생산과정 조절 안정된 물성 확보 생명공학적 수율 증대 발효조건 생산조절 연속배양 다양한 기능성 소재 개발 질, 양적 균일 다당류 생산 대량생산 비용절감

  17. 미 생 물 다 당 류 세포내 다당류 (Intercellular polysaccharide) : PHB, glycogen 구조 다당류 (Structure polysaccharide) : lipopolysaccharide, teidchoic acid, glucan 세포외 다당류 (Extracellular polysaccharide) : dextran, levan, pullulan, xanthan, alginate

  18. Microbial Exopolsaccharide Ex) Slimed cyanobacterial strains EPS Cyanothece sp. (775 x) Nostoc sp. (194 x)

  19. Microbial Exopolsaccharide Sheathed cyanobacterial strains EPS Chroococcus sp. (1000 x) Phormidium sp. (1,000x)

  20. Microbial Exopolsaccharide Capsuled cyanobacterial strains EPS Cyanothece sp. (775 x) Nostoc sp. (480 x)

  21. 유용 유전자 신소재 효소 세포외 다당류 부착능 해 양 생 물 막

  22. 환경적응을 위한 미생물 EPS 효과 • 표면 부착 • 박테리아 세포의 집합, 생물막 형성 • 세포간 인지 • 생물막 구조적 요소 • 방어벽 • 보습성 유지 • 외부 유기 혼합물의 흡착 • 비유기 이온의 흡착 • 효소 활성 • 효소와 다당류의 상호작용

  23. Microbial biopolymers Xanthan : Xanthomonas campestris 광범위 온도, pH 점도우수  식품첨가제 Gellan : Pseudomonas slodea, Sphingomonas pancimobilis 증점제, 안정제  젤라틴 대체 식품첨가제 Curdlan : Agrobacterium sp. 높은온도에서 액상 환원안됨  천연 껌 대체 황산염유도체  항바이러스 Wellan : Alcaligenes sp. xanthan과 유사, 열안정성 우수  윤활제 높은 pH에서 칼슘과 반응성 우수  건축분야 Ramsan : Alcaligenes sp. 낮은 전단력, 유동학적  현탁액, 페인트첨가

  24. UDP-D-galactose + P-lipid D-galactose-PP-lipid UDP-D- glucuronic acid UDP D-glucuronic acid D-mannose-D-galactose PP-lipid D-mannose-D-galactose PP-lipid UDP-D-galactose UDP Polysaccharide 세포내 다당류 합성 UMP GDP-D-mannose GDP D-galactose-D-mannose-D-galactose-PP-lipid + D-glucuronic acid Fig. Mechanism of biosynthesis of polysaccharide-chain in the cell.

  25. REACTION CONTROL Substrate Substrate entry MEMBRANE Hexose-phosphate CYTOPLASM Hexose-P level XDP-Hexose XDP-Hexosehydrolase and pyrophosphorylase Lipid-P-P-Hexose Isoprenoidlipid availability Lipid-P-P-Oligosaccharide Polysaccharide 다당류 합성의 조절

  26. 해양 미생물 유래 세포외다당류 개발

  27. 해 양 미 생 물 해수, 해양 동식물, 퇴적층에 서식하는 세균, 진균류, 단세포 조류, 원생동물, 바이러스 해 양 환 경 평균수심 : 4,000m 염분 : 35 ‰ 온도 : 연평균 5℃ 저온성, 빈영양성, 친압성, 호염성의 특성

  28. 해양미생물유래 EPS 개발 추진체계 • 균주분리, 배양 • biofilm 군집 • cyanobacter • heterotophe 유용성 검색 기술 1 단계 산업적이용 기반기술 확립 특성분석 이용기술 생산조건 • 배양조건확립 • 유용유전자 • 분리정제법 • 식품첨가제 • 생리활성 • 산업소재 • 물성 • 분자량 • 단당류 성분 • 점도 • 리올로지 • 분자구조 • 의존성: pH, • 온도, NaCl 2 단계 신기능성 산업 소재로의 개발 안정성 및 유효성 검정 대량 생산 제품화 기술

  29. KOREA 3 5 B1 3 4 B3 B5 B7 B8 3 3 A1 A3 A5 A7 A9 A11 A13 A15 3 2 3 1 123 124 125 126 127 128 129 해양 미생물 시료채취지역 황해 및 제주 서남해역 남해안 연안지역

  30. A. 천연기질 표면 B. 인공기질 표면 C. 천연인공기질 표면

  31. 시화방조제 Oyi Island Sampling point Daebu Island Sungam Island Sampling of marine bactrium from slide glass

  32. 해양 미세조류 1차 배양 • ASN-III 배지에 접종한 filter 1차 배양 • 3000 Lux , 16/8 h, 20oC, 4주 배양

  33. 대량배양 및 polymer 확인 1. 순수 분리 균주의 small scale reacter 배양 2. 3주 배양 후 배지 1ml당 생성된 polymer 3. 생성된 polymer의 특성 분석을 위한 정제시료 2 3 1

  34. 순수 분리 균주 확보 Total nomberof isolatiedmarine bacteria and marine cyanobacteria Sampling point Marine bacteria Marine microalgae Subtotal 77 4 81 Dae-buIsland South Sea 678 603 1,281 Yellow Sea and Che-juisland 332 4 336 139 0 139 Dae-ho Embankment Total 1,226 611 1,837

  35. 균주선발 균주분리 균주보존 생산균주 1차 선발 균주동정 1. 다당류 생산량 2. 세포생장 균주의 배양학적 특성 회분식 배양에 의한 다당류의 생산 다당류의 분리 및 정제 다당류의 점성 다당류의 특성 다당류의 구조분석 다당류의 물성 1.FT-IR 2. NMR 3. UV 1. 농도에 따른 점도 2.온도에 따른 점도 3. 염농도에 따른 점도 4. pH에 따른 점도 5. 열처리에 의한 점도 6. 다른 다당류와의 혼합비교 7. 고유점도 1.다당류의 분자량 2.다당류의 조성 3. 원소분석 및 선광도 4. 정성반응 5. 단백질 함량 6. 유기조성 비교 1. 응집활성 2. 용해도 3. 융점 4. 수분활성도 5. 유화안정능 다당류 이용성 다당류의 대량생산 및 분리, 정제

  36. Alteromonas alvinellae 616 Alteromonas macleodii 995 00SS-11568 563 1000 marine bacterium ATAM407_18 polar sea bacterium R9875 1000 Arctic seawater bacterium R7215 1000 556 Glaciecola sp. HA02 Pseudoalteromonas bacteriolytica 563 Moritella japonica Idiomarina loihiensis Marinobacter aquaeolei Desulfovibrio acrylicus 0.1 OOSS-11568의 특성 • 분리지역 : 전라남도 여수시 • 용주리 포구 • cocoid형 • gram + • 1 – 2 m • Altermonas sp.

  37. 6 10 DEXTRAN 1 P-11568 5 10 Molecular weight(Da) DEXTRAN 2 4 10 8 9 10 11 12 13 14 Retention time(min) OOSS-11568의 분자량 • MW : p-11568 (4.4 x 105 ) • Blue dextran : MW 2,000,000, dexran : 1) MW 464,000, 2) MW 69,000 • 3. GPC : HPLC, flow rate : 0.5ml/min., ELSD detector Column : Showdex. 806M, eluent : water.

  38. glucose Xylose p-11568의 단당조성 • P-11568 (glucose : xylose = 3 : 1 ) • HPLC : cabohydrate column, 1.4ml/min., acetonitil : water = 80 : 20 • ELSD detector

  39. 1.0 5 5 0.14 4 1.60 1.55 0.8 4 0.12 1.50 4 3 1.45 0.10 1.40 0.6 3 1.35 Cell growth O.D.660 Viscosity (cp) EPS (g/l) Cell growth O.D.660 EPS (g/l) Viscosity (cp) 0.08 2 1.30 3 1.25 0.4 2 0.06 1.20 1 1.15 2 0.04 1.10 0.2 1 1.05 0.02 0 1.00 1 2 3 5 7 0.0 0 1 Glucose concentration (%) xylose fructose glucose galactose mannose sucrose starch con Carbon source Fig. Effect of carbon source on the production p-11568 and cell growth. Fig. Effect of glucose concentration on the production of p-11568 and cell growth. Viscosity (cp) Cell growth O.D.660 EPS (g/l) Viscosity (cp) EPS (g/l) Cell growth O.D p-11568 생산에 미치는 탄소원의 영향

  40. 0.30 4 1.8 0.30 7 10 9 1.7 0.25 0.25 6 8 3 1.6 7 0.20 0.20 5 6 1.5 Cell growth O.D.660 Viscosity (cp) EPS (g/l) 2 0.15 Cell growth O.D.660 5 EPS (g/l) Viscosity (cp) 1.4 0.15 4 4 0.10 3 1.3 1 0.10 3 2 0.05 1.2 1 0.05 0 2 1.1 0.00 0 yeast pepton typton malt beef urea con 1 3 5 7 10 con Organic carbon Yeast extract concentration (%) Fig. Effect of organic carbon source on the production of p-11568 and cell growth. Fig. Effect of yeast extract on the production of p-11568 and cell growth. EPS (g/l) Viscosity (cp) EPS (g/l) Cell growth O.D Viscosity (cp) Cell growth O.D 0.070 1.44 7 1.42 0.065 6 1.40 0.060 5 1.38 0.055 4 Cell growth O.D.660 Viscosity (cp) EPS (g/l) 1.36 0.050 3 1.34 0.045 2 1.32 0.040 1 1.30 0.035 1.28 0 KNO3 NH4H2PO4 (NH4)2SO4 NH4CL NH4NO3 Inorgnaic nitrogen source Fig. Effect of inorganic nitrogen on the production of p-11568 and cell growth. Viscosity (cp) Cell grwth O.D.660 EPS (g/l) p-11568 생산에 미치는 질소원의 영향

  41. 8 6 0.14 0.7 7 6 7 5 0.12 0.6 5 6 4 0.10 0.5 5 6 4 Cell growth O.D.660 EPS (g/l) Viscosity (cp) 0.4 Cell growth O.D.660 4 3 0.08 3 Viscosity (cp) EPS (g/l) 0.3 3 2 0.06 5 2 0.2 2 1 0.04 1 0.1 1 0.0 4 0 0 0 0.02 0.5 1 5 con 0.5 1 5 con K HPO concentration. 2 4 concentration. KH PO 2 4 Fig. Effect of K HPO concentration on the production of p-11568 and cell growth. 2 4 Fig. Effect of KH PO concentration on the production of p-11568 and cell growth. 2 4 Viscosity (cp) EPS (g/l) Cell growth O.D.660 EPS(g/l) Viscosity (cp) Cell growth O.D p-11568 생산에 미치는 무기인산의 영향

  42. 0.10 6 2.6 3 5 1.0 5 2.4 0.08 4 0.8 4 2 2.2 0.06 3 0.6 Viscosity (cp) EPS (g/l) Cell growth O.D.660 Cell growth O.D.660 Viscosity (cp) EPS (g/l) 3 2.0 2 0.4 0.04 1 2 1.8 1 0.2 0.02 1 1.6 0 0 0.0 0.00 0 1.4 0.01 0.03 0.07 0.1 0.2 con 0.05 5 10 15 20 con CaCl concentration (g/l) 2 NaCl concentration (%) Fig. Effect of CaCl2 concentratio on the production of p-11568 and cell growth. Fig. Effect of NaCl concentration on the production of p-11568 and cell growth. Viscosity (g/l) EPS (g/l) Cell growth O.D.660 Cell growth O.D.660 Viscosity (cp) EPS (g/l) 9 6 0.35 1.65 4 0.5 8 0.30 1.60 5 0.4 1.55 3 7 0.25 4 1.50 6 0.20 0.3 Viscosity (cp) Viscosity (cp) EPS (g/l) 3 Cell growth O.D.660 Cell growth O.D.660 EPS (g/l) 1.45 2 5 0.15 0.2 1.40 2 4 0.10 1.35 1 0.1 1 3 0.05 1.30 2 0 0.00 1.25 0 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.5 con FeSO4 CuSO4 MnSO4 ZnSO4 CoCl2.6H2O KCl con Micro element MgSo concentration (g/l) 4 Fig. Effect of MgSO4 concentration on the production p-11568 and cell growth. Fig. Effect of micro element of the production of p-11568 and cell growth. EPS (g/l) Viscosity (cp) Cell growth O.D.660 Viscocity (cp) EPS (g/l) Cell growth O.D.660 p-11568 생산에 미치는 무기염의 영향

  43. 9 8 7 FInal pH 6 5 3 22 2 20 18 16 2 1 14 EPS (g/l) Viscosity (cp) Cell growth O.D.660 12 10 1 0 8 6 4 0 2 2 4 8 12 24 36 48 72 96 120 144 con Time (H) Final pH EPS (g/l) Viscosity (cp) Cell Growth O.D.660 5 L Jar fermentor를 이용한 p-11568의 생산 Fig. Effect the time course on the production of p-11568 and cell growth.

  44. 20 L jar fermentor를 이용한 p-11568의 생산

  45. p-11568의 미세구조 A C A B The scanning electron microscope of p-11568 at different concentration. (A : 1.0%, B : 0.5%, C : 0.1%, 25,000 x) C

  46. p-11568 의 리올로지 특성 Gellan gum, Xanthan gum에 대한 1% 수용액 물성 Xanthan gum P-11568 Gellan gum Relationship between shear stress and shear rate according to mix of Gellan & Xantan gum

  47. Xanthan gum p-11568 Gellan gum Relationship between viscosity and shear rate according to each polysaccharides p-11568 의 리올로지 특성 Gellan gum, Xanthan gum에 대한 1% 수용액 물성

  48. p-11568 물성학적 특성 1. p-11568의 물성계수 1) non-Newtonian fluid 2) power-low model : 1%수용액, consistency index(K) 4,404, flow behavior index(η ) 0.42 2. 농도에 따른 p-11568의 물성변화 - 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 % 농도에서 전단응력은 농도에 비례하여 증가 3. 온도에 따른 p-11568의 물성변화 1) 10, 25, 40, 60 oC에서 온도가 상승할 수록 전단응력 감소, 온도 재저하시킨 경우 점도 2) 가역용액 물성 4. pH에 따른 p-11568의 물성변화 - pH 2, 4, 7, 8, 12에서 큰 변화 없음 5. 염(NaCl, CaCl2) 첨가에 의한 p-11568의 물성변화 - NaCl 농도 증가할 수록 전단응력 감소, CaCl2의 경우 전단응력은 증가 6. 열처리에 따른 p-11568의 물성변화 1) 60, 80, 100 oC에서 열처리한 후 전단응력 감소 2) 불안정한 열안정성 7. Gellan 및 xanthan gum과 의 혼합에 의한 p-11568의 물성변화 - 동일농도 0.5% gellan 및 xanthan gum과 혼합시 물성형 변화 없음

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