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蛋白质研究技术

蛋白质研究技术. 蛋白质含量测定 蛋白质分子量测定 蛋白质电泳分析 蛋白质层析分析 蛋白质免疫分析 现代蛋白质研究策略. 1 蛋白質定量法. Biuret  法 銅離子在鹼性溶液中，會與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合，生成紫色的複合物. Lowry  UV 吸光法 : 由於各種蛋白質所含芳香族氨基酸組成不一，它們在 280 nm 的吸光能力亦不同 Coomassie Blue (dye binding) 法. 2 分子量测定. 膠体過濾法 梯度電泳法 其他分子量測定方法 a 超高速離心法 b 由氨基酸序列計算分子量

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蛋白质研究技术

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Presentation Transcript

  1. 蛋白质研究技术 蛋白质含量测定 蛋白质分子量测定 蛋白质电泳分析 蛋白质层析分析 蛋白质免疫分析 现代蛋白质研究策略

  2. 1蛋白質定量法 • Biuret 法 銅離子在鹼性溶液中，會與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合，生成紫色的複合物. • Lowry  • UV吸光法: 由於各種蛋白質所含芳香族氨基酸組成不一，它們在 280 nm 的吸光能力亦不同 • Coomassie Blue (dye binding)法

  3. 2 分子量测定 • 膠体過濾法 • 梯度電泳法 • 其他分子量測定方法 • a超高速離心法 • b由氨基酸序列計算分子量 • c質譜儀分析 • d电泳分析　

  4. 泳动率只和分子的大小有关

  5. 以电泳确定蛋白质的分子量

  6. 3 蛋白質構造與組成分析 • N-端或 C-端氨基酸決定 • 氨基酸組成分析 • 氨基酸定序法 • cDNA 間推法 • Edman 直接定序法 • 短肽图譜 • 蛋白質的專一性水解 • 檢定胜汰群的方法 • 其他相關方法 • 分子消光係數 • 蛋白質分子結構分析

  7. A 氨基酸序列测定 • 蛋白质序列测定的关键步骤：   （1）氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来（化学法）：   （2）正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基（衍生生色基团，HPLC分离分析） • N端序列分析N端分析原理：Edman降解法N端蛋白质自动序列仪N端封闭：甲酰甲硫氨酸、乙酰丝氨酸、苏氨酸

  8. N-端或C-端氨基酸決定：

  9. C端序列分析 C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，环化，进一步转化为乙内酰硫脲（TH）→Alkylation烷基化修饰硫原子，形成ATH衍生物→酸性条件下，ATH衍生物与[NCS]-反应而被裂解生成ATH-氨基酸，新的C末端自动形成TH。

  10. B 蛋白质序列拼接 • 用几种的方法断裂多肽样品，形成几套肽段，分别测定肽段的氨基酸序列后，根据不同裂解方法得到的肽段不同，找出不同裂解方法下具有的共同跨切口的重叠肽，可以拼接出整个多肽的氨基酸序列。

  11. C 蛋白质测序的新方法 • 用测定核酸序列的方法推测蛋白质的序列： 以待测蛋白质为抗原免疫动物得到相应的抗体，并以此抗体去沉淀合成这种蛋白质的多核糖体，分离出其中的mRNA并将它反转录成cDNA，通过测定cDNA的核苷酸序列，反推知蛋白质的氨基酸序列。

  12. DNA RNA (mRNA) ? protein 蛋白质测序新方法原理

  13. 由蛋白質基因的核甘酸序列，可推得其氨基酸序列，是目前最常用的定序方法 (reverse biochemistry)。 此基因一般選殖自 cDNA 庫，在經過群殖、定序等工作，轉譯成蛋白質的氨基酸序列後，就可進行系統性的分析工作；通常以 電腦程式 搜尋比對，例如 PC/GENE (個人電腦用) 或 GCG (工作站)。

  14. 4 蛋白质分析技术

  15. 蛋白质分析技术免疫學工具的利用︰ • 若能得到蛋白质的抗体，則對此蛋白质的研究將有非常大的幫助，因為抗体的專一性很高，可做為專一性的探針，廣泛地應用在 ELISA、免疫沉澱 或 免疫轉印 上。

  16. 蛋白質的微量分析技術

  17. 总蛋白分析

  18. 总结 • 单击显示 蛋白质相关研究技术

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