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一、实验目的. 学习和初步掌握玉米小斑病抗性鉴定技术。 1 、玉米小斑病的主要症状特征观察。 2 、玉米小斑病的接种方法。 3 、玉米小斑病的病情与抗性级别鉴定。. 二、内容说明. 玉米小斑病（ Helminthosporium maydis ） 是温暧潮湿地区玉米产区广泛发生的一种病害，也是我国玉米生产上的主要病害之一，流行年份往往造成严重损失。选育抗病自交系和杂交种，是防治小斑病最经济有效的措施。玉米从幼苗到成株均可发病，通常从下部叶片开始向上蔓延，先从叶面产生褐色小点，后扩大成 2~3mm 的褐色病斑，病斑受叶脉限制，常常成不规则形。发病适温为 25~30 ℃ 。.
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一、实验目的 学习和初步掌握玉米小斑病抗性鉴定技术。 1、玉米小斑病的主要症状特征观察。 2、玉米小斑病的接种方法。 3、玉米小斑病的病情与抗性级别鉴定。
二、内容说明 玉米小斑病（Helminthosporium maydis）是温暧潮湿地区玉米产区广泛发生的一种病害，也是我国玉米生产上的主要病害之一，流行年份往往造成严重损失。选育抗病自交系和杂交种，是防治小斑病最经济有效的措施。玉米从幼苗到成株均可发病，通常从下部叶片开始向上蔓延，先从叶面产生褐色小点，后扩大成2~3mm的褐色病斑，病斑受叶脉限制，常常成不规则形。发病适温为25~30℃。
内容说明(续) 根据小斑病菌侵染特点的不同，可将小斑病菌划分为O小种和T小种两个生理小种。T小种对T型细胞质有专化毒性，故育种上应尽量避免使用有专化性的细胞质类型。玉米对小斑病抗性表现亦有两种，一是多基因控制，表现为病斑数量少，在保湿条件下，病斑形成的孢子少，孢子形成时间较长。二是由隐性单基因rhm控制，表现为小的褪绿病斑。 鉴定玉米育咱材料抗小斑病的方法有自然诱发鉴定，大田诱发鉴定和人工接种鉴定。但以人工接种鉴定较为可靠。
三、所需用品和操作方法 （一）所需用品 1、材料：供试玉米材料、玉米抗病和感病对照材料。玉米小斑病菌种，T小种的培养物；上一季感染O小种小斑病的玉米植株病叶。 2、仪器用具：高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、接种环、恒温箱、烧杯、漏斗、试管、纱布、玻璃棒、培养皿、显微镜、小喷雾器、保湿罩等。 3、药品试剂：75%酒精、0.1%升汞溶液、葡萄糖、琼脂、马铃薯等。
（二）操作方法 1. 苗期接种鉴定 （1）菌种的培养 ①病原菌的分离 选取新鲜病叶作为分离材料，在灭菌室内进行操作。先将病斑剪成4~5mm2大小，约30~40块，然后分别将病组织小块置于0.1%升汞溶液中消毒1min，立即取出，按无菌操作方法投入无菌水中清洗三次，每次2~3min。最后以无菌操作方法，将病斑组织按正方形四点排列，栽种在PDA平板培养基（去皮马铃薯20g，葡萄糖10~20g，琼脂17~20g，水100ml）上，置25~30℃温箱中培养约7天。
② 菌种的纯化 选取培养性状典型的菌落，按无菌操作方法移植到斜面培养基上（每个典型菌落移3管），然后再放在25℃恒温下培养。待产生孢子后，选取菌落较一致的斜面1~2管，挑取一点，观察孢子的形状、分隔数、脐点特点。然后计测孢子大小。确认纯种后，再用斜面培养基扩大培养，让其产生大量孢子后，置冰箱中保存待用。
（2）孢子悬浮液的制备 用少量无菌水倒入已产孢子的斜面培养基试管中，猛力摇动冲洗孢子。也可辅以接种环表层刮除。最后将所有冲洗孢子液集中在洁净的三角瓶中。用纱布滤去菌丝及培养基，滤液用蒸馏水稀释，调至在100倍显微镜下每个视野有5个孢子浓度的悬浮液待用。
（3）接种病菌 接种小斑病的适宜时期是在玉米6个叶片左右。接种前在配制好的孢子液中加入2%蔗糖，以促进病菌孢子萌发。接种菌液量是每株1~2ml。用微型喷雾器均匀喷雾，喷后立即以塑料袋套盆保温，置25℃左右温度下保湿24小时。
（4）病情鉴定和分级标准 接种后7~10天即可进行病情鉴定。鉴定应在同一天内完成。鉴定项目和标准如下： ① 发病程度 以叶片为单位进行鉴定。根据病斑占叶片面积的百分率，记载每片叶的感病程度。发病程度分为9级（表1）。鉴定接种部位的叶片，每株4片叶，每个供试材料10株共40片。 以整株为单位，根据整株的发病情况，分为7个等级（表2）。而后，以叶片为单位，计算病叶率和病情指数。
等级 病斑占叶片面积（%） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2—5 6—10 11—20 21—30 31—50 51—70 >70 0级 1级 2级 3级 4级 5级 6级 7级 8级 表1 玉米小斑病叶片发病程度分级标准
0.5级 1级 2级 3级 4级 5级 0级 表2 玉米小斑病整株发病程度分级标准
病情鉴定和分级标准（续） ② 病斑长度 随机测量40个独立的病斑，每株4个，以mm为单位。 ③ 抗病性的反应型 病斑反应型分为三级，分级标准见表3。
褪绿病斑型 坏死型 萎蔫型 表3 玉米小斑病抗性反应型分级标准
2. 成株期接种鉴定 ①接种：抽雄前将粉碎的头一年病叶撒入心叶喇叭口，接种应在下午或傍晚湿度较大时进行。天气干燥时，接种后可在每株心叶喷水。 ② 病情鉴定和分级标准：抽丝后15天左右进行病情鉴定，鉴定应在同一天内完成。发病程度以整株为单位，分7个等级。分级标准见表2。一般用于苗期和成株期抗病性鉴定。整株调查中，植株上、中、下叶片的划分，以第一果穗上下两片叶为中部叶，其下为下部叶，其上为上部叶。
0.5级 1级 2级 3级 4级 5级 0级 表2 玉米小斑病整株发病程度分级标准
③ 病株率和病情指数计算 病株率和病情指数计算方法是以整株为单位进行。
四、作业 1、玉米小斑病发病的适宜条件是什么？ 2、玉米小斑病的典型特征为何？ 3、玉米小斑病鉴定的基本环节有哪些？ 4、玉米小斑病接种的要点是什么？ 5、玉米品种对小斑病抗性表现分几级？各级表现如何？
参考文献 [1] 玉米遗传育种学编写组，1979，玉米遗传育种学，230—260，科学出版社。 [2] 方中达，1998，植病研究方法，p373—376，中国农业出版社。
