Использование ДНК- биочипов для диагностики вирусного гепатита С

1. I-ый Казахстанский Медицинский Диагностический Форум «Инновационные технологии в радиологии (КТ, МРТ, ПЭТ, УЗИ), лабораторной и функциональной диагностике» 23-24 сентября 2014 г., г.Астана Использование ДНК-биочипов для диагностики вирусного гепатита С Д.м.н., профессор кафедры инфекционных и тропических болезней КазНМУим.С.Д.АсфендияроваШопаева Г.А. 24.09.2014 г.

2. HCV-инфекция • Значительный рост показателей заболеваемости в мире • Начиная с 1998 г., инфицированность населения вирусом гепатита С (HCV) растет с опережающей по отношению к вирусу гепатита В (HBV) быстротой • Частое поражение лиц молодого возраста • Высокий уровень хронизации (~ 75-85%) • Исход в цирроз (27%) и первичный рак печени (25%) * • Полиморфизм внепеченочных поражений • Трудности лабораторной диагностики • Отсутствие специфической профилактики Мультидисциплинарная проблема * Alter MJ. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 2007.- 13. – Р.2436–41. [PMCID: PMC4146761] [PubMed: 17552026]

3. Динамика многолетней заболеваемости острыми, хроническими вирусными гепатитами в Республике Казахстан

4. Заболеваемость хроническими вирусными гепатитами (впервые выявленные) в РК

5. Естественное течение HCV-инфекции Ekta Gupta, MeenuBajpai, and AashishChoudharyHepatitis C virus: Screening, diagnosis, and interpretation of laboratory assays //Asian J Transfus Sci. 2014.- 8(1).- P.19–25.

6. Значение внепеченочных поражений при HCV-инфекции Могут приобретать ведущее значение в клинической картине болезни и быть причиной позднего распознавания хронического гепатита С «Маски»ХГ-С неврологические ревматологические нефрологические дерматологические гематологические эндокринологические офтальмологические

7. Гепатит С симптомы симптомы HCV антитела РНК HCV титр AЛT 2 0 1 3 4 5 6 1 5 10 20 месяцы годы Острый гепатит Хронический гепатит Цирроз, ГЦК

8. Диагностика ВГС • Клиническая диагностика • Лабораторная диагностика • Широкое распространение малосимптомных и латентных форм инфекции, высокий хрониогенный потенциал, неблагоприятные исходы, отсутствие эффективной специфической профилактики предопределяют особую значимость решению проблем ранней диагностики заболевания, генотипирования и эпидемиологического мониторинга. • Требуется развитие быстрых и надежных лабораторных методов ранней диагностики, мониторинга развития и течения ВГС.

9. Диагностика ВГС Антигенные микрочипы Секвенирование Масс-спектрометрия • Клиническая диагностика • Лабораторная диагностика (системы ранней диагностики ВГ) Серологические методы обнаружения Иммуноферментный анализ Прямые методы обнаружения ПЦР в реальном времени Методы типирования Технологии на основе использования биочипов

11. География генотипов HCV Thong VD, Akkarathamrongsin S, Poovorawan K, TangkijvanichP., Poovorawan Y. Hepatitis C virus genotype 6: Virology, epidemiology, genetic variation and clinical implication //World J Gastroenterol2014, March 21.- 20(11).-P.2927-2940.

12. Распределение генотипов HCV в популяции РК Исследование в РК, n= 466 Земан В.В., 2004 Центрально-Азиатская Гастроэнтерологическая Неделя, Алматы, 17-21 сентября, 2013

13. Определение генотипа/субтипа ВГС HCV

14. Диагностика ВГС. Использование биочипов • Применение биочипов в исследовательских и диагностических целях представляет собой самую обширную область потенциального роста. • Использование данной технологии позволяет определить соответствующую тактику лечения для каждого конкретного больного (персонифицированная терапия). • С целью выявления и генотипированиявируса гепатита С разработана и используется тест-система INNO-LiPA HCV (“INNOGENETICS”, Belgium) на основе принципа обратной гибридизации со специфичными для определенного генотипа вируса гепатита С зондами, иммобилизованными в виде полос на нитроцеллюлозную мембрану1,2. 1 Stuyver L., Rossau R., Wyseur A. et al. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay //J.Gener.Virol. – 1993. – Vol.74. – P.1093-1102. 2Maertens G., Stuyver S., Rossau R., van Heuverswyn H. Process for typing HCV isolates // United States Patent. – 2003. – No6. – 548,244 B2.

15. Выявление всех ВГС const • 1ab • 1а • 1b • 2a • 2b • 3а • 3b • K+ на систему выявления • K+ на постановку анализа Тип 1a 1b 2a 2b 3a 3b Шаблоны для выявления анализируемой матрицы генотипа HCV В 2005 г. в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, Россия) был разработан способ выявления анализируемой последовательности ДНК с использованием высокоселективных олигонуклеотидных зондов на основе модифицированных («мостиковых») олигонуклеотидов (зав.лабораторией д.м.н. Пышный Д.В.).

16. Принцип работы ДНК-чипа • Разработка ДНК-чипа основана на обратной гибридизации иммобилизованного на твердофазный носитель HCV-специфичного олигонуклеотидного зонда с высококонсервативным участком кДНКHCV. • Использование составных или «сшитых» тандемов трех коротких олигонуклеотидов позволяет достоверно отличать последовательности, содержащие одну нуклеотидную замену. • Данный способ диагностики реализуется посредством тест-системы, содержащей пробирку с капроновым чипом (5х15 мм), промывочные и буферные, а такжеферментативные растворы.

17. С помощью предложенного нами, совместно с разработчиками ДНК-чипа, способа диагностики вирусного гепатита С с использованием ДНК-чипов, в основе которых лежит вышеописанный способ выявления последовательности ДНК, было протестировано 65 образцов крови от больных вирусным гепатитом С (в том числе в сочетании с туберкулезом легких), проживающих в г.Алматы. Генотипирование HCV с помощью ДНК-чипов

18. Сканированные изображения ДНК-биочипов после проведения анализа на ПЦР-образцах ##1, 2, 5, 7, 8, 9, 11 9 11 номер ПЦР-образца 7 1 8 2 5 1b 2a 3a 3a 3a 1а 3bрезультат генотипирования с помощью тест- системы

19. Результаты генотипированияс использованием новой тест-системы (метод III) сопоставлены с данными, полученными референс-методами – прямого секвенирования нуклеотидной последовательности 5’-UTR HCV (метод I); коммерчески доступными тест-системами «ДНК-технология», «АмплиСенсHCV-генотип» (г.Москва, Россия)(метод II) Примечание: 1 – генотипированиеHCV с использованием тест-системы «ДНК-технология» 2 – генотипированиеHCV с использованием тест-системы «АмплиСенсHCV-генотип»

20. Таким образом, • Молекулярно-биологические методы повышают эффективность этиологической диагностики в раннем периоде HCV-инфекции. • Способ генотипирования HCV на основе олигонуклеотидных ДНК-чипов позволяет проводить одновременно детекцию и генотипированиевируса гепатита С, а также дифференцировать генотип 2 (2а, 2b) и определять субтип 3b вируса в отличие от широко используемых коммерческих тест-систем. • Предлагаемый способ соответствует референс-методу (секвенирование) определения генетического материала.

21. Молекулярная диагностика. Реалии и перспективы … • Перспективы развития молекулярной диагностики (в т.ч. биочипы) вирусных гепатитов на сегодняшний день связывают с нерешенными проблемами в этой области, в частности, • прогноз течения и исхода заболевания • оценка степени активности гепатита и степени фиброза печени без гистологического исследования • прогноз эффективности ПВТ до ее начала • ранее выявление неэффективности лечения • ранняя диагностика рака печени. • Реализация принципа персонифицированной терапии. • Качественно новый уровень решения проблем ранней диагностики, лечения и профилактики ВГС.

22. Благодарности • Разработчикам методики генотипирования вируса гепатита С с использованием олигонуклеотидных ДНК-чипов – сотрудникам лаборатории нанотехнологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г.Новосибирск (зав.лабораторией д.х.н. Д.В.Пышный). • Cотрудникам ПЦР-лаборатории Научной лаборатории им.Г.КюнцигераКазНМУим.С.Д.Асфендиярова (заведующая – канд. мед. наук, доцент Ш.А.Бейсембаева). • Исследование проведено в рамках Программы прикладных научных исследований Министерства здравоохранения РК«Разработка и внедрение высокоэффективных геномных технологий в диагностику и прогнозирование течения и исходов инфекционных заболеваний», 2006-2008, № ГР 0106РК00418.

23. Спасибо за внимание!