现代生物技术试验四绿色荧光蛋白工程菌株的构建与表达调控黄绍松

现代生物技术试验四绿色荧光蛋白工程菌株的构建与表达调控黄绍松现代生物技术试验四绿色荧光蛋白工程菌株的构建与表达调控黄绍松

实验目的 • 掌握质粒DNA的分离纯化、酶切连接、电泳分析，感受态的制备，质粒的热激转化与电击转化，转化子的筛选与目的基因的诱导表达等一系列分子生物学基础实验方法 • 通过实验深入理解实验原理和相关理论 • 充分理解操纵子模型在表达调控中的作用机理 • 在实验体会掌握实验过程的安排与控制，微量操作和避免污染在分子生物学实验中的重要性。

实验原理 在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子(DNA重组)；将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一目的DNA分子(基因克隆)；目的基因在受体细胞、重组载体和外界因素的共同作用下表达，达到大量生产其编码的保持生物活性的蛋白质或实现受体细胞新的生物学特征的目的的过程（基因工程）。

大肠杆菌DH5-a 具有表达元件质粒的菌株 B pEV-32 挑取单菌落过夜培养含gfp基因的菌株A CT-gfp 主要内容及实验流程液体接种培养4-6小时质粒提取电泳检测质粒提取电泳检测氯化钙处理制备感受态质粒纯化酶切,获得gfp基因质粒纯化酶切获得插入缺口热激转化，筛选回收gfp基因片段回收能插入外源片段的表达载体V 转化子的鉴定与诱导表达片段的连接gfp+V=pEV-gfp

实验过程控制 第一天 1.试剂，耗材清洗灭菌，培养基的制备 4h 2.三株菌的活化培养过夜:12h 3.质粒提取纯化、电泳检测 4h 4.感受态的制备 3h 5.质粒的酶切过夜 6.酶切片段的电泳分离与回收 3h 7.筛选与诱导表达培养基的制备 4h 8.回收片段的连接过夜 9.热激转化 2h 10.转化子的筛选 12h 11.诱导表达与鉴定 12~16h 第二天第三天第四天第五天

具体操作参见 1.分子生物学实验指导刘进元张淑平武耀廷第二版（教材）基础实验部分 2.分子克隆实验指南 J.萨姆布鲁克 D.W拉塞尔主编黄培堂译 p1~103 1564~1616 3.关于蛋白结构、质粒图谱查阅网址：www.ncbi.nlm.gov 4.各种试剂性能特征参见；www.biosupplynet.com 5.试剂盒及各种酶在使用之前请详细阅读其附带的说明书

实验的理想结果 转化前转化后

DNA重组基本过程 目的基因表达载体构建的表达质粒

1、获取片段及重组

2、转化

3、筛选

4、表达及表达产物的纯化 表达产物分离纯化

DNA重组基本程序包括下列过程 分—获取目的基因和载体切—使用工具酶把目的基因和载体切割成可连接的片段接—目的基因与载体的连接转—重组DNA导入宿主细胞筛—重组DNA的筛选与鉴定表—目的基因在受体细胞内的表达

一、目的基因的获取（分） 目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。目的基因来源 1）制备基因组DNA 2）制备cDNA 3）聚合酶链反应 4）人工合成基因

（一）制备基因组DNA（基因文库） 分离、纯化基因组DNA条件：温和，在EDTA或SDS等存在下 ↓RE用蛋白酶K消化细胞、酚抽提大小不同酶切片段片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离 ↓ 分别与同样RE消化的载体连接常用噬菌体载体或质粒载体 ↓DNA连接酶连接。导入细胞进入宿主细胞内培养扩增。 ↓ 筛选鉴定用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。

（二）制备cDNA（cDNA文库） （1）合成cDNA第一条链反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。引物是与mRNA3ˊ端 polyA互补的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二条链 RNase去掉模板mRNA （3）构建cDNA文库 ①　cDNA两端加接头或衔接头接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。 ②　cDNA与载体相连。 ③　导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。

（二）制备cDNA（cDNA文库） 分离目的基因的mRNA 逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链得到平端双链cDNA 导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库

（三）聚合酶链反应( PCR) 在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因。（四）人工合成基因引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段。

二、目的基因与载体的连接（接） （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2）平头末端连接 3）人工接头法 4）同源多聚尾连接法

（一）粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。（二）平头末端连接某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。

（三）人工接头法 合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。

（四）同源多聚尾连接法

三、重组DNA导入宿主细胞（转） 无性繁殖体外重组后的DNA导入受体细胞，形成转化子。然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。克隆从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞进行无性繁殖时所采用的受体细胞.

重组DNA导入宿主细胞的类型 转化以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。感受态细胞用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。

四、重组DNA的筛选与鉴定（筛） （筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1）平板筛选 2）限制酶切图谱筛选 3） PCR筛选重组体 4）原位杂交技术插入失活蓝－白筛选

（一）平板筛选 • 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 • 如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能 • 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转 • 化的则不能生长。 • 插入失活 • 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使 • 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的 • 培养平板上。

抗生素平板筛选（插入失活）

（2）蓝-白筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。载体：编码β-半乳糖宿主：编码β-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列（IPTG 存在下） α-互补细菌表达：β-半乳糖苷酶活性蛋白↑ 5-溴-4-氯-3-吲哚（X-gal） → 形成蓝色菌落当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。

蓝－白筛选示意图

2. 限制性内切酶图谱鉴

3. PCR筛选重组体 抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。 4. 原位杂交技术

五、重组体在宿主细胞中的表达和调控基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。克隆基因表达有三个条件⑴ 基因的编码区不能被插入序列所中断;⑵ 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别;⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。

基因工程生产胰岛素的原理（示意图）

三、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。

四、改良物种特性

动物药厂 通过转基因动物生产感兴趣的基因 ↓ 把YFG放在β—乳球蛋白的启动子下 ↓ 注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内 ↓ YFG在乳腺中表达 ↓ 乳汁中提纯YFG蛋白。

五、动物克隆 1. 分离体细胞（先处于“饥饿”的“静止状态”） →使“关闭”的基因全部“打开”。 2. 植入去核的卵细胞中→胚胎细胞 3. 将胚胎细胞植入寄养母体内。

现代生物技术试验四 绿色荧光蛋白工程菌株的构建与表达调控 黄绍松