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第九章 遗传的物质基础. 9.1 遗传物质的本质. 一、 DNA 是遗传物质 （一） DNA 是遗传物质的证明 1928 年 Griffith 等进行的肺炎球菌转化（ transformation ）实验 . 1944 年 Avery 证明 DNA 是遗传物质. （二） DNA 携带两类不同的遗传信息 1 . 负责基因结构的信息 2 . 负责基因选择性表达的信息. 二、 RNA 也可作为遗传物质 （一） RNA 病毒 病毒颗粒（ viron ） ：由病毒 RNA 基 因组和包被在外的蛋白质外壳组成 . 病毒的生存方式： 病毒编码包装基因
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9.1 遗传物质的本质 一、DNA是遗传物质 （一）DNA是遗传物质的证明 • 1928年Griffith等进行的肺炎球菌转化（transformation ）实验. • 1944年Avery证明DNA是遗传物质.
（二）DNA携带两类不同的遗传信息 1.负责基因结构的信息 2.负责基因选择性表达的信息
二、RNA也可作为遗传物质 （一）RNA病毒 病毒颗粒（viron）：由病毒RNA基 因组和包被在外的蛋白质外壳组成. 病毒的生存方式：病毒编码包装基因 组所需的蛋白，以及一些在感染循环 中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白 质由宿主提供。因此病毒不能独立生 存。
（二）类病毒（viroid） 类病毒:是使高等植物产生疾病的有传染 性的因子，由很小的环状RNA分子构成。 与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染 因子。类病毒只由RNA组成，其中广泛 存在不完全的碱基配对，形成一种特有 的棒状结构。类病毒的基因组不能编码 蛋白质。
类病毒的复制：必须由宿主的酶来完成，其RNA作为模板。类病毒的复制：必须由宿主的酶来完成，其RNA作为模板。 类病毒对宿主的影响：类病毒可通过复制占有宿主细胞中关键的酶，从而影响宿主细胞的正常功能；类病毒也能影响必需的RNA的产生而引发疾病；它们还可以作为一个不正常的调控分子，对个别基因的表达产生特殊的影响。
三、是否存在核酸之外的遗传物质？ （一）朊病毒（prion）： 是一个28KDa的疏水性糖蛋白，由细胞 的核基因编码，在正常动物的脑组织中 有表达。 （二）朊病毒的存在形式： 朊病毒以感染性形式（PrPSC)，和非感染性形式（PrPC）两种形式存在。
（三）两种形式的朊病毒的异同： PrPC PrPSC 功能 ： 不详 导致退行性神经疾病 分 布： 正常脑 被感染脑 抗蛋白酶性： 可被完全降解 只能被部分降解 溶解性： 可溶 难溶 一级结构： 两者相同 二级结构： 40%-螺旋 20% -螺旋， 50%-折叠
（四）朊病毒的感染方式 PrPSC作用需要PrPC的参与 PrPSC蛋白的错误折叠形式可以催化天然PrPC分子从正常的可溶性的螺旋构象向不溶性的-折叠构象转化，最终导致了疾病和感染。
（五）朊病毒的多株现象 不同PrPSC株可使一种PrP结构转化为不同的构型；而同一种PrPSC可以在具有不同PrP蛋白的多种生物中传代，即使经过多次传代仍然保持自身的生物学特征。 （六）朊病毒是遗传物质吗？ • 多株现象难以解释 • 其感染方式能否被视为遗传复制？
9.2 DNA的一级结构 一、DNA一级结构的组成 一级结构： 4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序。 (一）含氮碱基（nitrogenous bases） • 胞嘧啶（cytosine, C）、 • 胸腺嘧啶（thymine, T）、 • 腺嘌呤（adenine, A）、 • 鸟嘌呤（guanine, G）
DNA中的常见碱基有： 胞嘧啶（cytosine, C）、胸腺嘧啶（thymine, T）、 腺嘌呤（adenine, A）和鸟嘌呤（guanine, G）
（三）脱氧核糖核苷（nucleoside） 由碱基和戊糖（D-脱氧核糖）缩合而成。 有4种脱氧核糖核苷：胞嘧啶脱氧核糖核苷、 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核 苷和鸟嘌呤脱氧核糖核苷。 + + H2O H
（四）脱氧核糖核苷酸 脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯
（五）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA） 脱氧核糖核苷酸以3’，5’磷酸二酯键聚合成为 脱氧核糖核酸（DNA）链。链的一端的核苷酸有自 由的5’磷酸基团，称5’端；另一端核苷酸具有自由 的3’羟基，称3’端。 一个脱氧核苷酸的3'端与下一个的5'端通过磷酸二酯键连接。
DNA链的方向就是从5’端 到3’端。 DNA分子通常以线性或环 状的形式存在。大多数 DNA由两条互补的单链构 成。少数生物的DNA，如 某些噬菌体或病毒是以 单链形式存在的。
二、序列测定方法 （一）小片段重叠法 （二）凝胶直读法 1.酶法 （1）加减法（Sanger,1975） （2）末端终止法(双脱氧法/间接拷贝法)（Sanger,1977） 2.化学法（Maxam/Gilbert,1977） 适用于DNA短片段的测定
末端终止法的应用——循环测序（cycle sequecing)实验及原理 a.测序反应的设定 • 体系中包括：DNA模板，TaqDNA聚合酶，寡核苷酸引物，4种dNTP 和荧光ddNTP（4种荧光）等 b.反应 • 包括：DNA变性，引物与模板配对，DNA聚合酶使引物延伸（在引物3’末端接上dNTP或ddNTP）； c.反应的终止 • 20-30个循环后，新合成所有可能的DNA片段，每个片段的3’末端都被接上ddNTP，延伸终止； d.反应产物电泳分离及检测 • 在聚丙烯凝胶中，不同大小的DNA片段在高压电场作用下迁移，小分子迁移速度快，先被位于凝胶底部的装置检测到。 e.结果的处理及输出 • 根据被检测到的DNA片段的顺序及颜色，绘出DNA片段的电泳图谱。DNA序列中的每个核苷酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来
引物 5 ‘ 3 ' 模板 5 ' TACGATCGTATG3 ' 酶、4种dNTP 3 ' ATGCTAGCATAC5 ' 5 ' TACGATCGTAT3 ' A G T C 5 ' TACGATCGT3 ' 5 ' TACGATCGTA3 ' 5 ' TACGAT3 ' 5 ' TACGA3 ' 5 ' T3 ' 5 ' TACGATC3 ' 5 ' TACGATCG3 ' 5 ' TA3 ' 5 ' TAC3 ' 5 ' TACG3 ' ddATP ddGTP GTATGCTAGCAT ddTTP ddCTP
9.3 DNA的二级结构 一、DNA螺旋的几种构象及其动态平衡 （一）Watson – Crick右手双螺旋结构 （B-DNA构象） 相对湿度为92%时， DNA钠盐纤维为B-DNA构象。 在天然情况下， 绝大多数DNA以B构象存在。
Watson—Crick双螺旋结构模型特点： a.反平行双链右手螺旋 b.糖－Pi在螺旋线上 c.碱基伸向内部其平面垂直于轴 d.A=T、G=C e.直径=2nm，一圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nm f.大沟（major groove）、小沟（minor groove）
DNA双螺旋结构的要点 • （1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′→3′，而另一条链的方向为3′→5′。
DNA双螺旋结构的要点 • （2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°角。
DNA双螺旋结构的要点 • （3）螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。
DNA双螺旋结构的要点 • （4）两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。碱基的相互结合具有严格的配对规律，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）结合，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。 • 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。
（二）A-DNA构象 • 为相对湿度改变（75%以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链分子均采取A构象。
（三）Z-DNA构象 • 在一定的条件下（如高盐浓度），DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。
A-型 B-型 Z-型
B-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA变成A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后，活性明显降低。B-DNA是活性最高的DNA构象，B-DNA变成A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后，活性明显降低。
二、决定双螺旋结构状态的因素 （一）氢键 1.碱基的氢供体 氨基、羟基 2.碱基的氢受体 酮基、亚氨基 3.G-C对及A-T对 之间的氢键: （在一定范围内DNA的稳定性与G-C百分含量成正比）
（二）碱基堆积力 • 1，碱基堆积力 同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力 • 2，碱基堆积力的来源 疏水作用力 累积的Van der Waal的作用力 • 3，碱基堆积作用的证据 单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构 破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的稳定性
TA不稳定 Pu的抵牾发生在小沟一侧 Py---Pu 2倍抵牾力 Pu的抵牾发生在大沟一侧 Pu---Py 相临两个Bp间的Pu发生过份的挤压导致Bp的抵牾 DNA分子的精细结构发生改变，产生构象的不安定状态 GC稳定 碱基堆积形成积压 Pu的双环结构，其长度接近或超过螺旋轴心 每对Bp又以propeller twist 形式存在
（三）带电荷的磷酸基的静电斥力 • 磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液的离子浓度越低，DNA越不稳定。 （四）碱基分子内能 • 碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易被破坏，DNA双链越不稳定
9.4 DNA的三级结构 一、超螺旋结构 DNA的三级结构是指DNA双螺旋的进一步扭曲盘绕所形成的构象，主要表现为超螺旋结构。 形成超螺旋的原因和条件： 原因：因某种原因引入了额外的螺旋。 条件：a, DNA双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自由转动； b, DNA双链上无断裂。
a. b. 松弛态（relaxed state）: DNA中心轴与平面平行即不扭曲的状态。 超螺旋：双螺旋结构的DNA再次扭曲形成的螺旋结构。 a .右旋超螺旋—— 负超螺旋（Negative supercoil） b.左旋超螺旋—— 正超螺旋（positive supercoil）
环状DNA分子的拓扑学性质 L=T+W W=L-T L：连环数（ Linking number）指一个封闭环状DNA双螺旋分子中的两条链彼此盘绕的次数； T：双螺旋中转数（Twisting number，也叫螺圈数）是双螺旋本身所有的性质。其数量等于碱基对总数除以每一圈的碱基对数（如：5200÷10.4=500）； W：超螺旋数（Writhing number）。 DNA的拓扑异构体： 松弛型：W=0，L=T； 负超螺旋：L<T；正超螺旋： L>T
L=T+W W=L-T 例：动物病毒SV40的DNA（环状，含5200bp）， 在无超螺旋时， L=500，T=500，W=0； 但实际上从细胞中分离出的SV40DNA含有25个负 超螺旋，所以它的L=475，因此，L对一个DNA分子 来讲是一个拓扑学特性，在不发生链的断裂时 它是一个常数。（475=500-25）
比连环差（Specific linking difference)（以 表示） 用来表示超螺旋的程度；当初级螺旋 数不变时， 代表超螺旋密度。 公式： =（L-L0）/ L0 （L0：表示松弛环型DNA的连环数） 如一超螺旋DNA的L =23，L0 =25， 则 =-0.08，大多数天然存在的DNA 分子超螺旋密度在-0.03~-0.09之间。
超螺旋结构存在的意义 密度大，体积小，在细胞中 所占体积较为经济； 超螺旋结构能影响双螺旋的 解链程度，因而影响DNA分 子与其它分子，如酶、蛋白 质等分子的相互作用，参与 DNA复制、重组、转录等重 要功能。 DNA的拓扑异构体可用凝胶 电泳分开。
影响DNA高级结构的酶 L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一断可绕着另一端旋转，随后被重新连接，DNA拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。
拓扑酶功能比较 功能比较 消除负超螺旋 松弛B - DNA 引入负超螺旋 紧缩B- DNA l拓扑异构酶 (topoisomerase I, II)参与构型的改变 Top I 对负超螺旋处的单链DNA具有极强的亲合力 Top II
1. I型DNA拓扑异构酶 底物： DNA单链 ATP： 不需 酶活性：DNA内切酶和连接酶活性 代表： E.Coli的DNA拓扑异构酶I： 可催化负超螺旋DNA转化为 松弛环型。 鼠DNA拓扑异构酶I：对正、 负超螺旋有相同的松弛能力。
原理： • E.coli拓扑异构酶识别部分解螺旋的DNA分子，与DNA单链部分结合后，切断一条链，并以其酪氨酸残基与DNA的5’磷酸相连。磷酸二酯键从DNA转移蛋白质上。酶将完整的DNA链拉过缺口后（ ⊿L =+1），重新连接原先单链上磷酸二酯键。
上述过程除了改变DNA的超螺旋结构外，还可使单链环状分子形成三叶结构，以及使两个单链环状分子成为环连体分子。上述过程除了改变DNA的超螺旋结构外，还可使单链环状分子形成三叶结构，以及使两个单链环状分子成为环连体分子。
2. II型DNA拓扑异构酶 • 底物 DNA双链 • ATP 需要 • 酶活性 DNA内切酶和连接酶活性 • 代表 E.Coli旋转酶（DNA拓扑异构酶II），可引入负超螺旋。无ATP时，此酶只能缓慢地松弛负超螺旋。
E.Coli的旋转酶还具有形成和拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。E.Coli的旋转酶还具有形成和拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。 • 此类酶无碱基序列特异性。
