第十二章 DNA 的复制和修复本章重点介绍遗传中心法则和 DNA 的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对 DNA 的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。

第十二章 DNA的复制和修复本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。

中心法则 DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。思考 返回

复制 DNA 转录逆转录蛋白质 RNA 翻译复制遗传信息传递的中心法则生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。

目录 第一节 DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）第二节逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）第三节 DNA的损伤与修复第四节 DNA突变第五节 DNA的遗传重组

第一节 DNA的半保留复制 一、概念和实验依据二、DNA聚合反应有关的酶类三、DNA的复制的起始点和方式四、原核细胞DNA的复制过程五、DNA复制的忠实性六、真核细胞DNA的复制

DNA的半保留复制的概念 DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。

[15N] DNA DNA的半保留复制实验依据 [14N- 15N] DNA 1958年Meselson & stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制. [14N- 15N] DNA [14N] DNA

B    A        B      C   C     环状DNA的复制 A 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验) 将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（ B）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。

3´ 5´ 解旋酶解链酶引物酶和引发体 SSB RNA引物 DNA聚合酶III DNA聚合酶I 3´ 3´ 5´ 5´ RNA引物原核生物DNA聚合反应有关的酶类（1）DNA聚合酶(DNA polymetases) （2）引物酶(peimase)和引发体(primosome)：启动RNA引物链的合成。 (3） DNA连接酶（DNA ligase）（4）DNA解链酶(DNA helicase) (5）单链结合蛋白(single-strand binding protein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。 (6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。

3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ RNA引物 DNA聚合酶催化的链延长反应模板链 3´ 5´ 子链

大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 DNA 聚合酶Ⅰ DNA 聚合酶Ⅱ DNA 聚合酶 比较项目 109，000 400 + + + 1 400，000 10-20 + + - 50 分子量每个细胞的分子统计数 5´-3 ´聚合酶作用 3´-5 ´核酸外切酶作用 5´-3 ´核酸外切酶作用转化率 120，000 100 + + - 0 .05 复制切除引物修复功能修复 1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair）

3´- 5´核酸外切酶水解位点 DNA聚合酶的3´- 5´外切酶水解位点 5´ 3´ 错配碱基 5´ 3´

DNA聚合酶5´- 3´外切酶活力 5´ 单链缺口 5´- 3´核酸外切酶水解位点

         DNA聚合酶Ⅲ 两个亚基夹住DNA DNA聚合酶Ⅲ异二聚体大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能核心酶引物的结合和识别校对促使核心酶二聚化延长因子

ATP或NAD＋ AMP+PPi或NMN+AMP 5' 3' 模板链连接酶连接切口 A G T G A A C C T T C T G G T A A C 5' 3' P P P P P P P P P OH 缺口连接酶 Mg2+ 3' 5' 模板链 A G T G A A C C T T C T G G T A A C P P P P P P P P P 5' 3'

起始点 起始点起始点未复制DNA 起始点复制叉的推进单向复制复制叉双向复制环状DNA复制时所形成的Q结构复制叉复制叉 DNA的双向和单向复制

DnaA蛋白结合位点 四个9bp序列成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列 GATCTNTTNTTT TTATCCACA 大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型 SSB DnaA DnaB (解螺旋酶) 大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

解旋酶 解链酶引物体 SSB RNA引物 DNA聚合酶III DNA聚合酶I 随后链 3´ 3´ 3´ 5´ 前导链 RNA引物 5´ 3´ 复制叉的移动方向原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制的起始 DNA链的延长 DNA链终止 3´ 5´

大肠杆菌复制体结构示意图 拓扑异构酶II 解螺旋酶引物合成酶引发体  -复合物 RNA引物单链结合蛋白（SSB）聚合酶III核心酶聚合酶III核心酶 -聚体 -夹子 -夹子滞后链 RNA引物前导链聚合酶I

引物的消除和缺口的补充

oric 大肠杆菌染色体复制的终止复制叉1 复制叉2 复制叉1 复制叉2 连锁染色体完成复制 DNA拓扑异构酶 终止复制叉2 终止复制叉1

1、终止区域 大肠杆菌DNA上存在多重拷贝的 Ter顺序，这种Ter顺序长20bp，包括TerA、 TerB、 TerC、 TerD、 TerF 和TerG，它们在DNA上排列以创造出一种“陷阱”,阻止复制叉的移动。防止过分复制。 DNA复制的终止过程

顺时针复制叉 逆时针复制叉逆时针复制叉陷阱顺时针复制叉陷阱 11

2、当任意一个复制叉碰到一个功能性Tes-Tur复合物时，就停止。而另一个复制叉碰到第一个被阻止的复制叉时也停止前进。这些大复合物中间的几百个核甘酸对以一种未知的机制被复制。完成两个环行染色体的拓扑学联系。分开这种连环需要拓扑异构酶Ⅳ。2、当任意一个复制叉碰到一个功能性Tes-Tur复合物时，就停止。而另一个复制叉碰到第一个被阻止的复制叉时也停止前进。这些大复合物中间的几百个核甘酸对以一种未知的机制被复制。完成两个环行染色体的拓扑学联系。分开这种连环需要拓扑异构酶Ⅳ。

解旋酶 引物体解旋酶引物体引物聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型

复制的忠实性 DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点: DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7 10-6） DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’ 外切酶切除）  起始时以RNA作为引物

5´-核酸外切酶 聚合中心 3´-核酸外切酶裂缝内部裂缝 DNA聚合酶的校对功能

DNA聚合酶的校对功能 切除错配核苷酸错配硷基正确核苷酸聚合酶复制方向 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´

起始时以RNA作为引物的作用 DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。

起点起点起点起点起点起点真核细胞DNA复制的特点  多个起点复制  真核生物的DNA聚合酶  端粒（telemere）复制

DNA 聚合酶  DNA 聚合酶  DNA 聚合酶  DNA 聚合酶  分子量亚基数细胞内分布酶活力百分比外切酶活力 110-23，000 多个细胞核～80% 无 45，000 一个细胞核 10 ～15% 无 120，000 一个细胞核和线粒体 2 ～15% 无- 400，000 一个细胞核+ 10 ～25% 5-3 外切酶真核生物的DNA聚合酶

C AAAACCCCAAAACCC C C A 5´ 3´ 端粒酶（telomerase） DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。端粒酶

端粒合成的完成 TTTTGGGGTTTTG 3´ 5´ 5´ AA 3´ TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT C AAAACCCCAAAACCC n C C 3´ A AA 5´ 3´ TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG 5´ TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT n TT 5´ 3´ 3´ AA CCCCT AA 3´ C AAAACCCCAAAACCC 5´ C C TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT A TT 5´ 3´ 3´ AAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n 移位和再杂交 T T TGGG TGGG 3´ AA TTTTG 5´ GTTTTG 进一步加工 C AAAACCCCAAAACCC C C A 继续延伸 5´ 3´ 端粒合成的一种模型整合和杂交

真核和原核DNA细胞复制比较

第二节 DNA的损伤与修复 某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤. DNA的修复主要有以下类型: 一、光裂合酶修复二、切除修复三、重组修复四、诱导修复（SOS修复）暗修复五、错配修复

DNA紫外线损伤的光裂合酶修复 1、形成嘧啶二聚体 2、光复合酶结合于损伤部位 3、酶被可见光激活 4、修复后酶被释放

DNA的损伤和切除修复 结构缺陷碱基丢失碱基缺陷或错配糖苷酶切开切开核酸内切酶 AP核酸内切酶切除切除核酸外切酶核酸外切酶碱基取代插入酶修复 DNA聚合酶连接 DNA连接酶

所谓切除修复，即是在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。所谓切除修复，即是在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。这是比较普遍的一种修复机制，它对多种损伤均能起修复作用。切除修复包括两个过程：一是由细胞内特异的酶找到DNA的损伤部位，切除含有损伤结构的核酸链；二是修复合成并连接。切除修复的分子机制

细胞内有许多种特异的DNA糖苷酶（glycosylese），它们能诀别DNA中不正常的碱基，而将其水解下来。例如，在DNA复制过程中聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力是不高的，因此常有少量脱氧尿苷酸掺入到DNA链中去。大肠杆菌的dUTP酶可以分解dUTP成dUMP，但是它的作用有限，仍然不能完全避免dUTP的混入。而且，胞嘧啶脱氨基后也会转变成尿嘧啶。对于DNA链上出现的这些尿嘧啶，细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以把它除去。腺嘌呤脱氨后形成次黄嘌呤，这一不正常的碱基可被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉。细胞内有许多种特异的DNA糖苷酶（glycosylese），它们能诀别DNA中不正常的碱基，而将其水解下来。例如，在DNA复制过程中聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力是不高的，因此常有少量脱氧尿苷酸掺入到DNA链中去。大肠杆菌的dUTP酶可以分解dUTP成dUMP，但是它的作用有限，仍然不能完全避免dUTP的混入。而且，胞嘧啶脱氨基后也会转变成尿嘧啶。对于DNA链上出现的这些尿嘧啶，细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以把它除去。腺嘌呤脱氨后形成次黄嘌呤，这一不正常的碱基可被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉。

无嘌呤（apurinic）或无嘧啶位点（apyrimidinic site）常称为AP位点。烷化剂可使碱基被修饰，如甲基磺酸甲酯作用于DNA可引起鸟嘌呤第7位氮原子，或腺嘌呤第3位氮原子甲基化。糖苷酶可识别并除去烷基化碱基。另一些糖苷酶可识别其他的碱基缺陷。AP位点也可由DNA的碱基被修饰后造成N-糖苷键不稳定而自发水解产生；酸也能使DNA脱嘌呤。

一旦AP位点形成后，即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。不同AP核酸内切酶的作用方式不同，或在5’侧切开，或在3’侧切开。然后核酸外切酶将包括AP位点在内的DNA链切除。DNA聚合酶I兼有外切酶活性，并使DNA链3’端延伸以填补空缺,DNA连接酶将链连上。在AP位点必须切除若干核苷酸后才能进行修复合成，细胞内没有酶能在AP位置直接将碱基插入，因为DNA合成的前体物质是核苷酸而不是碱基。一旦AP位点形成后，即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。不同AP核酸内切酶的作用方式不同，或在5’侧切开，或在3’侧切开。然后核酸外切酶将包括AP位点在内的DNA链切除。DNA聚合酶I兼有外切酶活性，并使DNA链3’端延伸以填补空缺,DNA连接酶将链连上。在AP位点必须切除若干核苷酸后才能进行修复合成，细胞内没有酶能在AP位置直接将碱基插入，因为DNA合成的前体物质是核苷酸而不是碱基。

通常只有单个碱基缺陷才以碱基切除修复(base-excision repair)方式进行修复。如果DNA损伤造成DNA螺旋结构较大变形，则需要以核苷酸切除修复(nucleotide-excision repair)方式进行修复。最常见的是短片段的修复（short-patch repair）；只有多处发生严重的损伤才会诱导长片段修复（long-patch repair）。损伤链由切除酶（excinucleme）切除。该酶也是一种核酸内切酶，但在链的损伤部位两侧同时切开，与一般的核酸内切酶不同。

编码此酶的基因是Uvr基因，由多个亚基组成。大肠杆菌ABC切除酶包括三种亚基：UvrA(相对分子质量104000）,Uvr B(相对分子质量78000）和Uvr C(相对分子质量68000）。由Uvr A和Uvr B蛋白组成复合物（A2B），它寻找并结合在损伤部位。Uvr A二聚体随即离解，留下Uvr B与DNA牢固结合。

然后Uvr C蛋白结合到Uvr B上，Uvr B切开损伤部位3’侧第5个磷酸二酯键，Uvr C切开乡侧第8个磷酸二酯键。结果12～13个核苷酸片段（决定于损伤碱基是1个还是2个）在Uvr D解螺旋酶帮助下被除去，空缺由DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶填补。人和其它真核生物的酶水解损伤部位3’侧第6个磷酸二酯键以及5’侧第22个磷酸二酯键，切除27～29个核苷酸片段，然后用DNA聚合酶E和DNA连接酶填补空缺。

DNA的重组修复 胸腺嘧啶二聚体复制修复复制重组 DNA聚合酶核酸酶及重组蛋白 DNA连接酶

诱导的细胞 RecA促使分解LexA 单链DNA ATP recA大量表达靶基因表达 lexA靶基因表达但产物被分解 SOS反应的机制未诱导的细胞 LexA(阻遏物) RecA(辅蛋白酶) 靶基因 lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏 recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）

第三节 DNA的突变 DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。一、突变的类型 碱基对的置换(substitution) 移码突变(framesshift mutation) 二、诱变剂的作用 碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂(base modifier) 嵌入染料(intercalation dye) 紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation)

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- 颠换插入转换 -T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C- T 缺失 -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C- A 野生型基因 DNA突变的类型碱基对的置换(substitution) 移码突变 (framesshift mutation)

第十二章 DNA 的复制和修复 本章重点介绍遗传中心法则和 DNA 的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对 DNA 的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。