pH10

1. La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF) v = velocità di migrazione della proteina in un campo elettrico E = forza del campo elettrico z = carica netta della proteina f = coefficiente frizionale = 6r  = viscosità del mezzo v=E·z·f-1 3500 V proteine acide proteine basiche catodo anodo + + + + pH3 pH10 - step1 step2 - step3 - pI, punto isoelettrico  Z=Ø  v= Ø Sample preparation First dimension Second dimension Detection Image Analysis MALDI-TOF MS ESI MS/MS Tot 76 kVh Parma , 8 Novembre 2001

2. Sample preparation First dimension Second dimension Detection Image Analysis MS analysis Perché la I° dimensione è così importante nella 2-DE ? Una I° dimensione eccellente assicura che gli spots (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella II° dimensione, anche quando una grande quantità di proteine viene analizzata Perché le IPG strips sono così importanti nella I° dimensione ? • il gradiente di pH immobilizzato è stabile ed evita il fenomento della “catodic drift” ; • se sono noti i valori di pI delle proteine d’interesse, l’intervallo di separazione IEF viene ristretto e ne consegue un’analisi estremamente mirata (>accuratezza e precisione) ; • elevata risoluzione proteica ; • alta riproducibilità dei risultati ; • le proteine estremamente acide o basiche sono più facilmente separabili ; • IPG buffers con stesso intervallo di pH delle IPG strips sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre o elimina il background nella colorazione del gel …. I° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001 La I° dimensione : IPG strips Immobilized PH Gradient strip = IPG strip

3. La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE 1. La miscela proteica è sottoposta a : H3C-(CH2)10-CH2OSO3-Na+ Sodio dodecil solfato (SDS) = detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti delle proteine native + Mercaptoetanolo e ditiotreitolo = riducono i ponti disolfuro 2. Gli anioni dell’SDS si legano alle catene principali in un rapporto di : ~ 1 molecola SDS • 2 residui di amminoacidi 3.  I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa  MM proteica I° dimensione : l’importanza Parma , 8 Novembre 2001 Nella II° dimensione in condizioni denaturanti(“elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE”) le proteine sono separate in un gel di poliacrilamide in base alla loro massa molecolare (MM) • Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal catodo- all’anodo+ in base alla loro MM

4. La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE - CATODO IPG strip - Gel di poliacrilamide + 45 mA + ANODO

5. I° DIMENSIONE (IEF) : II° DIMENSIONE (2D-PAGE) : 12 IPG strips / corsa 12 gels / 4-6 ore 10 gels / 15-20 ore 12 IPG strips / corsa Hoefer DALT unit (APB) Multiphor II (APB) Ettan DALT II System (APB) IPG Phor (APB) Giorno 1 Giorno 2 Giorno 3 Giorno 4 Giorno 5 16.00 13.00 12.00 17.00 16.00 t 9.30 Equilibrazione Equilibrazione Reidratazione o.n. Separazione IEF Preparazione 2°dimensione Preparazione 2° dimensione (GELS) Preparazione 2° dimensione Separazione 2D-PAGE Fissazione e colorazione Analisi 2DE : le apparecchiature Parma , 8 Novembre 2001 Sistemi di analisi 2DE - strumenti

6. 2DE : vantaggi vs svantaggi Vantaggi vs vantaggi Parma , 8 Novembre 2001 Parma , 8 Novembre 2001 2DE Vantaggi Svantaggi Vantaggi • Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche (2.000–3.000 proteine) • Riproducibiltà e affidabilità dei risultati • Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti • Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine • fosforilazione • glicosilazione, • tagli proteolitici, • Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete • Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulare

7. 2DE : vantaggi vs svantaggi 2DE Vantaggi Svantaggi Svantaggi • metodica lunga • molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, fatica fisica • bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche • difficile separazione delle proteine molto acide o basiche • scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kDa • bassa risoluzione delle proteine poco rappresentative nel campione proteico • mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gel Vantaggi vs Svantaggi Parma , 8 Novembre 2001