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液相色谱基础

液相色谱基础. 本章内容： 液相色谱发展史 液相色谱的基本概念 影响峰形扩展的因素. 2. CH. 3. CH. H C. 3. CH. 3. N. N. 1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). Mg. 碳酸钙吸附剂. N. N. 石油醚. 3. CH. 1940‘s - 分配色谱和纸色谱. 1950‘s - 气相 , 薄层，凝胶过滤色谱. 0. 3. CH. 0. 0. 梯度洗脱色谱. 0. 0. CH. CH. CH.

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液相色谱基础

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  1. 液相色谱基础 本章内容： • 液相色谱发展史 • 液相色谱的基本概念 • 影响峰形扩展的因素

  2. 2 CH 3 CH H C 3 CH 3 N N 1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919) Mg 碳酸钙吸附剂 N N 石油醚 3 CH 1940‘s - 分配色谱和纸色谱 1950‘s - 气相, 薄层，凝胶过滤色谱 0 3 CH 0 0 梯度洗脱色谱 0 0 CH CH CH 1960‘s - 商业高效液相色谱. 3 3 3 • 历史回顾

  3. HPLC 结构框图 HPLC 结构框图 高效液相色谱 进样口 (HPLC) 混合器 泵 色谱图 色谱柱 检测器 溶剂

  4. 液相色谱类型 Types of Compounds Mode Stationary Phase Mobile Phase Separated Neutrals Reversed-Phase C-18, C-8, Water/Organic 化合物类型 模式 固定相 流动相 Weak Acids C-4, C-2 Modifiers Weak Bases 中性 弱酸 弱碱 反相 C18, C8, C4 氰基, 氨基 水/有机改性剂 C-18, C-8 Water/Organic Ionics, Bases, Acids Io子n-Pair Ion-Pair Reagent 离子、碱性、酸性 离对 C-18, C-8 水/有机的离子对试剂 Compounds Insoluble in Normal-Phase Silica, Amino, Cyano Organics Water, Organic Isomers Diol 不溶于水的化合物 正相 硅胶、氨基、腈基、二醇 有机物 Anion or Cation Ionics Ion Exchange Aqueous/Buffer Exchange Inorganic Ions Counter Ion Resin 离子型无机离子 离子交换 阴离子或阳离子交换树脂 水/缓冲溶液 对离子 Gel Filtration- Size Exclusion Polystyrene High MW Compounds Aqueous Silica Polymers Gel Permeation- Organic 高分子量化合物 聚合物 体积排阻 聚苯乙烯 硅胶 凝胶过滤 - 水性的 凝胶渗透 - 有机的

  5. tR(B) -tR(A) = 1.176 W1/2A + W1/2B tR(B) -tR(A) R = 2 WA + WB tR-t0 K’= t0 色谱参数 －定性和定量 tR(B) tR(A) t0 Detector Response A B Inject W W A B Time t = 保留时间 R 0 t = 死时间 W = 峰底宽度

  6. 不同R值的峰重叠 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1.00 1.25 R=1.5可以得到基线分离

  7. Δt α- 1 k' x x 1/4 = N R = α 1 + k' W 柱效 选择性 容量因子 影响R值的因素

  8. 容量因子 各组份的容量因子（K’）随溶剂洗脱强度的 变化增大或缩小 溶剂洗脱强度弱 1100 60% Acetonitrile 700 40% Water mAU 300 100 8 10 2 4 6 Time (min.) 增加流动相的洗脱强度，降低了洗脱物的容量因子 溶剂洗脱强度强 2000 80% Acetonitrile 1600 20% Water 1000 mAU 600 0 8 10 6 2 4 Time (min.) 对于反相色谱，增加10％的有机组成等于降低每个色谱峰的K’值的1/2 到2/3。

  9. α k' B = k' A A B A B A B 2 1 1 2 2 3 t 0 = 1 α α α k' 1.15 0.95 1.64 B 1.04 1.35 = = = = = 1.50 = = A k' 1.58 0.85 0.63 (α) 分离选择性 改用不同的流动相 改变流动相的组成 改变分离选择性α的方法 改变流动相pH值 改变柱温 应用特殊的化学效应 改变固定相

  10. 温度对分离选择性α的影响 40 ℃ 60℃ 10 0 5 Time in Minutes

  11. 柱效 低柱效 Detector Response 高柱效 Inject Time

  12. 扩散 范德姆特方程 The Van Deemter Equation A = 涡流扩散 HETP B = 自由分子扩散 C = 传质阻力 B . + u B h = A + C u u . u C A 线速度

  13. 扩散 初始 带宽 A = 涡流扩散——多径扩散 仔细填充柱子 使用均一的载体 最终 H E 带宽 T P A 线 速 度

  14. 扩散 B = 自由分子扩散——纵向扩散 在液相中影响小 在低流速中影响大 H E T B  P 线速度

  15. 扩散 C = 传质阻力 在低流速下可以降低传质阻力 使用小颗粒载体可以降低传质阻力 H E T P 流动相 . u C 线速度 滞流的 流动相 固定相

  16. 柱外效应 I. 样品体积 II. 连接管路的体积 III. 色谱柱进口设计 IV. 色谱柱出口设计 V. 检测池体积 ( < 10 µL ) 降低输出回路响应时间 VI.

  17. 如何提高分离度 通过下述方法增加保留时间: 选择合适的分离参数 增加色谱柱长度 增加固定相浓度 通过下述方法降低谱带宽度: 使用均一的载体 仔细填充柱子 选择粒度小的载体 优化流速 减小进样量 降低系统死体积 降低输出回路响应时间

  18. HPLC 仪器简介 • 本章内容： • 流动相及贮液罐 • 高压输液泵及梯度洗脱装置 • 进样装置 • 色谱柱 • 检测器 • 色谱数据处理装置

  19. 溶剂柜 脱气机 泵 手持控制器 自动进样器 柱温箱 检测器 堆积配置 • 优化流路减小死体积 • 流路自上而下

  20. 外设 (x4) HP-IB 连线 • 每个部分有独立的电源 • 1100各部件均由CAN线连接 • 检测器与化学工作站之间用 LAN线连接(或用HP-IB连接) • 脱气机与泵之间用遥控线连接 (错误信号输出) • BCD板用于外设和读取样品瓶数量

  21. 指示灯状态 仪器LED 状态显示 6种LED仪器状态： Off (power off) Ready (power on) Not Ready Run Error Resident Black Black Yellow Green Red Yellow blinking Blink 电源开关显示

  22. Agilent 1100 泵和在线脱气机 Agilent 1100系列泵,G1310A, G1311A, G1312A, G1354A 和Agilent 1100 系列在线真空脱气装 置(G1322A)

  23. 性能 /用途 • 与He脱气相比，更方便，更节省费用。 • 高性能脱气，避免了烦琐的操作，提高仪器稳定性。 • 内部延迟体积小，便于快速进行溶剂切换。 • 4通路系统，操作灵活。 • 与1100其它组件堆积在一起，用遥控线连接，用于传输错误信号。 建议 ... • 低压混合进行梯度洗脱，提高泵的可靠性能。 • 提高泵在低流速下的操作性能 • 用于需要脱氧的检测器 Agilent 1100系列真空脱气机

  24. 1 ml Solenoid valve 在线真空脱气机工作原理

  25. HP 1100 Series On-line Degasser: Influence on Detector Baseline Solvent: methanol; UV signal: 210 nm no degassing helium degassing Absorbency HP on-line degassing 2 4 6 3 5 7 8 9 1 Time (min)

  26. 溶剂传输系统 往复活塞泵(单向阀) Gold Seal Sapphire Insert Ruby Ball Spring Insert

  27. Pump head screws 泵头 - 单元/四元泵 Lock Screw

  28. Agilent 1100系列四元泵－G1354A; 真空脱气机为标准配置! 特征/优点 • 四通路/低压混合能灵活地进行恒梯度或梯度洗脱。 • 无需消耗昂贵的He而能进行高性能真空脱气。 • 自动冲程调节，混合非常均匀，降低基线噪音。 • 对于高盐流动相，可选择Seal Wash清洗密封垫。 建议 ... • 使用2，4，8mm内径的柱子 • 流量范围从 0.2到 10 ml/min • 应用于研究和常规分析

  29. Agilent 1100系列四元泵－G1354A 包括真空脱气机 溶剂柜 真空脱气机 G1322A 四元泵 G1311A

  30. 四元泵工作原理 Vacuum Chamber Vacuum Chamber from solvent bottles from solvent bottles Damper Damper Purge Valve MCGV 比例阀 AIV 主动阀 OBV 单向阀 to injection device AIV AIV OBV OBV Waste Waste Authoring Division Name File Name Security Notice (if required) Authoring Division Name File Name Security Notice (if required) MCGV MCGV

  31. Load Inject Sample Syringe To Waste To Waste To To Column Column Sample Loop From From Pump (Fixed Volume) Pump 手动进样器－六通阀

  32. 1 2 6 3 4 5 六通阀之扎针 泵 定 量 环 INJECT 废液 色谱柱 排空

  33. 1 2 6 3 4 5 六通阀之装样 泵 定 量 环 LOAD INJECT 废液 色谱柱 排空

  34. 1 2 6 3 4 5 六通阀之进样 泵 定 量 环 LOAD INJECT 废液 色谱柱 排空

  35. 六通阀之小刻度进样一 1 2 6 3 4 5 泵 定 量 环 LOAD INJECT 废液 色谱柱 排空

  36. 手动阀 流路连接 样品回路 废液 排空管 样品回路 到色谱柱 来自泵出口

  37. 手动进样器 样品定量管 前视图 后视图

  38. 固定相结构 • 本章内容： • 固定相载体结构 • 正相色谱固定相 • 键合相色谱固定相

  39. Typical Column Packing Supports OH OH OH O Si O OH Si Si Si Si O O O O Silica Gel Surface Chemically Modified Silica Gel CH Pores Si 3 Si Si - O - Si - (CH2)17CH3 CH Si 3 Si Si

  40. 正相 HPLC 极性固定相 有机流动相 硅胶 传统 吸附色谱 氧化铝 氰基 目前 二醇基 键合相 氨基 适用于: 同分异构体的分离. 在有机/水流动相中不溶化合物的分离. 适用于中等极性化合物分离.

  41. 硅胶柱和氧化铝柱的缺点 容易脱尾 样品被催化分解 不易梯度洗脱 含水量要控制

  42. 正相色谱键合相 Diol CH 3 CH OH CH CH Si Si O 2 2 OH CH 3 Cyano CH 3 O Si Si (CH ) C N 2 n CH 3 Amine CH 3 O Si ( ) CH Si CH NH n 2 2 2 CH 3

  43. Particles of Column Packings 50µm 30µm 3-10µm 2µm Active Surface Large Porous Pellicular Microparticulates Particles Beads

  44. 键合相柱优点 固定相不易被流动相洗脱 无需饱和色谱柱 非常容易进行梯度洗脱 柱子平衡非常快 使用极性范围宽 选择性唯一 柱容量大 溶质不易污染柱子

  45. TCC Agilent 1100 柱温箱

  46. 柱温箱的特征及优点 推荐 ... • 温度控制范围： 低于室温10℃～80℃ • 保留时间的再现性需要稳定 的温度 • 如果需要在高于或低于室温 进行分离操作时，需要使用 柱温箱 特征/优点 • 大空间，可以容纳三根30cm长色谱柱 • 更换柱子非常方便 • 降温非常方便 • 安装柱识别可以记录进样次数 • 使用切换阀可以进行柱切换(可选) • 两个单独的加热区可以分别控制温度 • 可以进行程序升温 • 内部死体积小(左侧3µL，右侧6µL)

  47. Agilent 1100 二极管阵列检测器 性能/优点... • 灵敏度高 (±1x10-5AU)。 • 两个灯，波长检测范围宽（190－950 nm）。 • 1024个二极管 和 1 nm 狭缝 。 • 可变狭缝。 • 根据不同需要选择流动池。 • 可以进行自动峰检索 。 • 利用紫外谱图进行峰确认 推荐 ... • 研究及方法开发 • 多波长检测 • 峰纯度检查 • 峰确认（定性）

  48. 进口管可以直接连接到色谱柱出口 钨灯 氘灯 流通池室 Front Elements - DAD

  49. DAD光路 钨灯 氘灯 耦合透镜 光源透镜 (消色差透镜) 阵列 支撑透镜 氧化钬滤光片 光谱透镜 Flow cell 狭缝 光栅

  50. 43.0% UV-VIS DAD Fluorescence Refractive Index 4.0% 22.0% Electrochemical 1.0% Conductivity 5.0% Mass spec 7.0% Others 10.0% 8.0% 检测器使用统计

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