Introduction à la Virologie :

1. Pourquoi travailler sur les virus ? • Qu’est ce qu’un virus ? • Interactions virus/hôte: (illustration a partir d’un exemple : le virus HIV) • Comment le virus se réplique ? • Mécanismes de défense de l’hôte et échappement du HIV au contrôle par l’hôte. • Comment peut on mettre en place des stratégies antivirales efficaces ? Introduction à la Virologie : Etienne DECROLY AFMB/MARSEILLE

2. Principales causes de mortalité dans le monde

3. NEW NEW > 9 virus ont « bougé » en 10 ans 1994- West-Nile virus: N Africa, Roumania, then USA (1999) 1997- H5N1: Honk-Kong, Viet-Nam 1997- Nipah virus: Malaysia 2000- Rift-Valley fever virus: crossed the Red sea… 2003- SARS coronavirus 2003- Monkeypox: USA 2005- Marburg virus (Ebola): Angola 2005- Japanese encephalitis: India 2005- Chikungunya virus: La Réunion, Indian ocean

4. Définition des virus • Travail individuel : • en 5 minutes tenter de définir la notion de virus • identifier les étapes putativement ciblées par des antiviraux • Travail collectif : • Définir la notion de virus

5. Définition des virus • Des objets biologiques, particulaires, de structure organisée. • Infectieux, subcellulaires, doués de continuité génétique. • Constitués au minimum d’un acide nucléique (ARN ou ADN) et de protéines. (soit l’ARN; soit l’ADN ; jamais les deux) • Ils sont des parasites intracellulaires absolus, et leur réplication dépend de la cellule hôte. • Ils ne possèdent pas d’appareil de traduction, ni de ribosomes. • Ils ne possèdent pas d’information génétique relative au métabolisme énergétique. • ils sont capables de perturber l’information génétique des cellules qu’ils infectent (mais ne provoquent pas obligatoirement la mort cellulaire). • Ce sont des organismes inertes en dehors d’une cellule vivante. • Ils sont capables de se transmettre de cellule à cellule. Tout être vivant est susceptible d’être infecté par au moins un virus (voie aérienne, cutanée, sexuelle ou par ingestion, par voie sanguine).

6. Corollaire • Certains composants du monde vivant ne sont pas des virus, mais s‘en rapprochent : • les organites cellulaires (en particulier les mitochondries). • les éléments génétiques mobiles formés d’ADN ? (les plasmides et transposons) • les viroïdes responsables de pathologies chez les végétaux. • les prions (agents transmissibles non conventionnels).

7. Rappel historique et quelques statistiques • Histoire naturelle de l’infection par le HIV • Organisation des particules virales • Le cycle réplicatif du HIV et cibles thérapeutiques Le virus HIV :

8. Pneumocystis carinii Sarcome de Kaposi Infections opportunistes • des cellules blanches (TCD4  500) • Immunodépression? • Transmission : Sexuelle Sanguine Mère enfant Syndrome d ’immunodéficience Acquise (SIDA) Le virus HIV : Introduction historique • 1981 : CDC Atlanta 1983 • 1981 : CDC Atlanta 1983 • L. Montagnier / R. Gallo : identification du rétrovirus (LAV/HTLVIII, HIV) • Biopsie ganglionnaires • Contrairement au HTLV1-1 qui immortalise les cellules (oncorétrovirus) il tue les Lymphocytes TCD4 (lentivirus) • Voie d ’entrée = récepteur CD4 (  des cellules CD4+) • Découverte du HIV-2 (F. Clavel) (moins pathogène/ Afrique de l’ouest) • Pandémie mondiale (+ de 40 millions de personnes infectées).

9. Etat actuel de l’épidémie (1)

10. Etat actuel de l’épidémie (2)

11. Etat actuel de l’épidémie (3)

12. Etat actuel de l’épidémie (4)

13. Etat actuel de l’épidémie en FRANCE (5) Situation en 2004 - (source : rapport delfraisy) • Personnes vivant avec le HIV/SIDA : entre 60 000 et 176 000 • Nouveaux cas d'infection à HIV en 2001 : 5 000 • Cas de SIDA déclarés depuis le début de l’épidémie : 54 781 • Décès dus au SIDA en 2001: 409 • Décès dus au SIDA depuis le début de l’épidémie : 32 119 • 60% des cas traiter = succes virologique

14. 1981 1982 1983 1987 1996 2004 20 ans de lutte contre le VIH Alerte sanitaire aux USA « SIDA » Isolement du VIH-1 Premier anti-rétroviral, l’AZT Premiers cas de résistance à l’AZT Premiers anti-protéases Apparition de virus multirésistants Situation dramatique en Afrique 20 millions de morts du SIDA 40 millions de personnes infectées

15. Rappel historique et quelques statistiques • Histoire naturelle de l’infection par le HIV • Organisation des particules virales • Le cycle réplicatif du HIV et cibles thérapeutiques Le virus HIV :

16. Histoire naturelle de l’infection HIV Evénements cliniques et biologiques se manifestant en dehors de toute intervention thérapeutique 4 phases : • La contamination • La primo-infection • L’infection asymptomatique • La maladie

17. I - La contamination • Le virus gagne les ganglions lymphatiques où il se multiplie. • Pas de test biologique capable de prouver la présence du virus. • En cas de contamination suspectée, il existe un traitement d’urgence: trithérapie devant être débutée dans les 24 h suivant l’acte contaminant et pendant un mois. Voies de contaminations : Sexuelle Sanguine Mère enfant

18. Résumé

19. VIRUS IMMUNITÉ IMMUNITÉ VIRUS 1010 virus fabriqués/jour Elimination quotidienne des virus Plusieurs années Destruction des cellules T CD4+ Destruction continue des cellules CD4+ Régénération accélérée des cellules CD4+ Apparition de maladies opportunistes Histoire naturelle de l’infection Phase asymptomatique SIDA

20. SCHEMA SIMPLIFIE DU DEROULEMENT CINETIQUE DES REPONSES ANTIVIRALES Rapides, peu diversifiées, spécificité dégénérée, efficacité restreinte pas de mémoire Réponses Immunitaires innées Réponses Immunitaires adaptatives lentes, très diversifiées, spécificité haute, efficacité forte mémoire

21. Les responses immunitaires aux virus : • Immunité Intrinsèque • défenses antivirales cellulaires : restrictions • Apobec3G, FV1, Ref1, Trim5 etc.. • Immunité Innée immédiate • défenses antivirales cellulaires • interférence ARN (destruction des mRNA) • ,Voies de la PKR (apoptose et inhibition traduction) • Voies TOL Mda5, de Rig-I et DAI … • émission de signaux de dangers • ligands de NKG2D, IFN-/ … • Système immunitaire adaptif: • Lymphocytes T CD8 (lyse des cellules infectées), LT CD4, • Lymphocytes B: anticorps (neutralisants, facilitants, ADCC) • Effets néfastes pour l’hôte: immunopathologie

22. Défenses de l’hôte VIRUS Défenses de l’hôte VIRUS Plusieurs années Pathogénèse du HIV Phase asymptomatique SIDA VIRUS • Efficacité réplicative du virus • Echappement au SI • Cellules cibles : CD4 • contrôle de la variabilité • hyper glycosylation • AC facilitants • Latence • Disfonctionnement du SI • Contrôle de l’immunité innée • Effet cytopathogène • cyncitas • Nef Défenses de l’hôte • Contrôle par le SI • Anticorps • Cellules T cytotoxiques • Défense cellulaire (immunité innée et intrinsèque) • Apobec 3G • contrôle de l’uracilation de L’ADN

23. Rappel historique et quelques statistiques • Histoire naturelle de l’infection par le HIV • Organisation des particules virales • Le cycle réplicatif du HIV et cibles thérapeutiques Le virus HIV :

24. Structure du virion

25. Structure du virion

26. Rappel historique et quelques statistiques • Histoire naturelle de l’infection par le HIV • Organisation des particules virales • Le cycle réplicatif du HIV et cibles thérapeutiques Le virus HIV :

27. Cycle d’infection par le HIV

28. Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Noyau Cycle de réplication du VIH-1

29. Identification du récepteur CD4 : • L’infection HIV induit une diminution du nombre de Lymphocytes T CD4+ • Des anticorps monoclonaux dirigés contre le CD4 bloquent l’infection in vitro • La GP120 co-immunoprécipite avec le récepteur CD4 • L’incubation du virus avec du CD4 recombinant titre l’infection HIV • Des cellules HeLa ne sont pas infectables par le HIV-1; elles le deviennent après transfection du gène codant pour le récepteur CD4 Une énigme subsiste : • Des cellules de souris qui ne sont pas infectables par le HIV-1 restent insensibles après transfection du gène codant pour le récepteur CD4 • Certaines cellules CD4+ humaines sont non infectables par le HIV IL DOIT EXISTER UN CO-RÉCEPTEUR

30. T20 Comment inhiber l’entré du virus

31. Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Décapsidation Noyau Cycle de réplication du VIH-1

32. Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Rétrotranscription Décapsidation Noyau Cycle de réplication du VIH-1

33. La rétrotranscription Mécanismes d’action des inhibiteurs de la RT 2 types d’inhibiteurs (modes d’action différent) Analogues de bases = Terminateurs de chaînes Exemples : les inhibiteurs nucléosidiques (NRTI) Les nucléotidiques (NtRTI) Inhibition par par modification du site catalytique de la RT Les inhibiteurs non nucléosidiques (NNRTI),

34. N3 N3 Mode d’action de L’AZT

35. Les analogues de base (NRTI et NtRTI) Les nucléosides (analogues de base non phosphorylés) Les nucléotides (analogues de base phosphorylés)

36. RT + ADN RT + Inhibiteur Non nucléosidique Inhibiteur non nucléosidiques de la RT Les informations structurale permettent de comprendre leur mode d’action.

37. Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Rétrotranscription Décapsidation Transport au noyau Noyau Cycle de réplication du VIH-1

38. Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Rétrotranscription Décapsidation Intégration Transport au noyau Noyau Cycle de réplication du VIH-1 Cellules infectée est un « provirus »

39. L’intégration • Lorsque la RT est finie, l’intégrase se repositionne aux extrémités du LTR, un dimère par LTR. D’autres protéines (NC et protéines cellulaires sont associées). • Elle enlève 2 bases à l’extrémité 3’OH (3’ end-processing). • Le 3’OH de chacun des brins fait une attaque nucléophile sur l’ADN cellulaire et coupe en quinconce. • Des activités cellulaires (flap endonuclease, polymerase, ligase) réparent et dupliquent les 4 à 6 bases du quinconce. • L’intégration se fait au hasard dans le chromosome(débat sur région + ou -transcriptionnellement active)

40. Structure de l’intégrase • Structure cristalline recherchée depuis 15 ans sans succès. Seul des domaines isolés sont connus. Protéine native quasi-insoluble et partiellement active. • 3 domaines, Zinc binding en N-term, Core catalytique central et C-term domaine qui est plus variable • Anti IN en phase II et I prochainement

41. Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Rétrotranscription Décapsidation Intégration Transport au noyau Noyau Cycle de réplication du VIH-1 Régulation latence post integrative/expression des virus

42. Fonctions promotrices du LTR 5’ • Certains facteurs de régulation sont spécifiques d’espèces et/ou de type cellulaires. Donc, outre le récepteur, les facteurs de transcription déterminent aussi la réplication virale dans une cellule/tissu/ou espèce. • La concentration intra-nucléaire de ces facteurs est très contrôlée par l’état d’activation cellulaire. Le niveau d’expression du virus sera aussi très dépendant de l’activation et/ou la différentiation cellulaire

43. Transactivation par des facteurs viraux

44. Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Rétrotranscription Décapsidation Intégration Transport au noyau Noyau Cycle de réplication du VIH-1 Traduction assemblage

45. ? Inhibiteurs Maturation protéolytique de Gag

46. Les inhibiteurs de la protéase virale • Premier inhibiteur de la protéase disponible en 1997 • La protéase clive les protéines virales précurseurs en protéines matures • Fixation des IP sur le site catalytique  inhibition réversible de la protéase

47. Maturation des particules virales Le clivage protéolytique des précurseurs viraux • permet de résoudre le paradoxe de l ’encapsidation/décapsidation

48. Les inhibiteurs de la protéase

49. Maturation de la particule HIV-1

50. Bourgeonnement Fixation au récepteur et au co-récepteur Cytoplasme Rétrotranscription Décapsidation Intégration Transport au noyau Noyau Cycle de réplication du VIH-1