Colture di cellule e di tessuti animali

2. Colture di cellule e di tessuti animali • Gli esperimenti biologici si possono condurre sia su organismi interi che su organi e tessuti animali isolati. Lavorando su tessuti e organi gli esperimenti in genere sono a breve termine, poichè è necessario mantenere il tessuto il più possibile in uno stato simile a quello fisiologico.

3. Perfusione

4. Le colture cellulari durano più a lungo e permettono una varietà di studi che con i tessuti non è possibile. In ogni caso sia i tessuti che le colture si possono utilizzare per diversi scopi che riguardano: • -lo studio del differenziamento cellulare (ciclo cellulare) • -studi patologici; • -modelli sperimentali in biochimica, farmacologia, fisiologia; • -manipolazione genetica; • -applicazioni biotecnologiche

10. Colture primarie e secondarie • Per colture primarie si intendono quelle colture ottenute da cellule provenienti direttamente dal tessuto, da embrioni, da cellule adulte in sospensione o da tumori. In genere contengono una miscela relativamente eterogenea di cellule in differenti stati fisiologici. Vi sono cellule che possono crescere in sospensione o adese ad un matrice artificiale tipo la plastica ma anche al collagene. • Le colture secondarie sono subcoltivazioni di colture primarie che si rendono necessarie quando le cellule giungono a confluenza ovvero coprono completamente la matrice a cui sono adese.

13. Curva di crescita • -la fase lag • - la fase log • m = 3.3(log Nx - log No) / (tx - to) • No numero cellule iniziali al tempo to • Nx numero cellule al tempo tx ; • m è espresso in ore h-1 • E’ noto che i procarioti crescono con scissione binaria, mentre gli eucarioti per divisione mitotica. In entrambi i casi la cellula si divide per dare origine ad altre due cellule. Pertanto, il tempo di raddoppiamento o di generazione sarà dato da: • g = 0.301 (tx – to) / log Nx – log No • -la fase stazionaria • -la fase di declino

14. stazionaria declino log lag Log numero di cellule vive tempo

16. Conservazione delle cellule: la crioconservazione • Il congelamento in azoto liquido è il metodo preferito per la maggior parte delle cellule eucariotiche, in queste condizioni a -196°C • la vitalità cellulare sia mantenuta per il periodo durante il quale il campione è conservato in azoto liquido. • La velocità con cui il campione viene congelato è molto importante • lenta diminuzione della temperatura • Uso di agenti crioprotettivi (DMSO, PEG)

18. Conta delle cellule al microscopio • aspirare il terreno liquido • lavagio con 5 ml di 1x PBS sterile (Phosphate Buffer Saline : KH2PO4 0.017M, Na2HPO4 0.05M, NaCl 1.5M); • trattare le cellule con tripsina (precedentemente riscaldata a 37°C); • aggiungere 4-5 ml di terreno • trasferire la sospensione cellulare in un tubo batteriologico; • 10ml di cellule di questa sospensione con 10 ml di soluzione Trypan Blue (diluizione 1/2). (Il colorante entra nelle cellule morte che risulteranno colorate di blu e quindi potranno essere riconosciute ed escluse dal conteggio) • 10ml di miscela ed un vetrino reticolato al microscopio ottico (quadrato grande = 0.1 ml) • contare le cellule vive (non colorata il blue) presenti in un quadrato. Per avere una misura statisticamente attendibile è necessario fare una media tra più quadrati; • aliquotare le cellule in base al numero di cellule che servono

19. Cellula morta

20. 100 cellule media di più quadrati • 100 x 10 = 1.000 • 1.000 x 2 =2.000 (diluizione) • 2.000 x 1000 = 2.000.000 cellule • 2.000.000 x ml totale delle cellule