1 / 39

sejtmembrán

Cél molekula:. fehérje. mRNS. DNS. oligonukleotid iránya. a leolvasással megegyezõ v. kettõsszálú. a leolvasással ellentétes. a leolvasással megegyezõ. mRNS. RNS DNS. duplex triplex. fehérjék. sejtmag. sejtmembrán. köcsönhatás. fehérje-DNS. RNS-DNS hibrid/ RNáz H.

kaden-landry
Download Presentation

sejtmembrán

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Cél molekula: fehérje mRNS DNS oligonukleotid iránya a leolvasással megegyezõ v. kettõsszálú a leolvasással ellentétes a leolvasással megegyezõ mRNS RNS DNS duplex triplex fehérjék sejtmag sejtmembrán köcsönhatás fehérje-DNS RNS-DNS hibrid/ RNáz H Hoogsteen féle triplex Gátlás transzkripciós szabályozás transzláció transzkripció Kromoszómális DNS citolplazma oligonukleotid Génexpresszió szabályozása szintetikus oligonukleotidokkal

  2. Triplex képződésének kölcsönhatásai homopurin homopirimidin szekvenciáknál

  3. Antiszensz oligonukleotidok lehetséges célszekvenciái a mRNS-en • exon-intron határhoz, slicing gátlás • Az 5’ sapka régióhoz • Transzlációs iniciációs régióhoz • Génen belüli régióhoz • Kapcsolódó oligonukleotidok Elsődleges hatásmechanizmus: Az endogén RNázH leemészti a DNS:RNS hibrid RNS szálát

  4. Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer B B 1 1 Ac O O O 2 O O H H O O O O hordozó hordozó B 1 B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O di-MeO Tr O O O I / H O B 2 2 1 di-MeO Tr O O B O 1 O O O P O O N C O O P O O N C O O hordozó hordozó

  5. Oligonukleotid szintézis:foszforamidit módszer B B 1 1 Ac O O O 2 O O H H O O O O hordozó hordozó B 1 B 1 O O O O di-MeO Tr A c O O 2% DCA/DCM O O di-MeO Tr hordozó hordozó < 1 % B 2 O O tetrazol di-MeO Tr O N újabb ciklus O P N N C O > 99 % B 2 B 2 O O di-MeO Tr O O O I / CS2 B 2 1 di-MeO Tr O O B O 1 O O O P O O N C S O P O O N C O O hordozó hordozó

  6. Oligonukleotid szintézis: H-FOSZFONÁT MÓDSZER H lehet Me is Előny: az oxidációt elég a végén elvégezni,vagy – igény szerint – el sem kell  töltés nélküli molekula  Könnyebben átmegy a sejtfalon/membránon

  7. PEPTID NUKLEINSAVAK (PNA) Nincs cukorfoszfát gerinc, ehelyett peptid kötéssel összekapcsolt lánc van Specifikus Stabil PNA T10-Lys TTTTTTTTTT-Lys PNA SV40-Lys ATTTTCTTCATTTTTTCTTC-Lys Ma már külön könyv van a PNA- alkalmazásairól

  8. MUTAGENEZIS - in vivo gének elrontására,vagy módosítására • Random mutagenezis • találomra létrehozott mutációk • mutagén anyagok: UV, kemikáliák, radioaktív sugárzás • PCR: a hőstabil polimerázok átírási hűsége rosszabb • mutagén törzsek • transzpozon mutagenezis Irányított mutagenezis Adott helyen - deléciók inszerciók léterhozása - pont mutációk létrehozása

  9. Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 Ar1 oriT ori Ar2 vad típus mutáns poláris hatás

  10. Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia Ar1 ori oriT vad típus mutáns poláris hatás ?

  11. Gének irányított mutagenezise a dut/ung rendszer alapján pontmutációk! Dut: dUTPase Ung: uracil-N-glikoziláz Ne épüljön be dezoxiuracil A DNS-be in vitro szintézis, Klenow

  12. QUICK CHANGE MUTAGENEZIS (STRATAGENE)

  13. FEHÉRJE TERMELTETÉS VAN GÉNÜNK: Legyen az prokarióta vagy eukarióta természetes vagy szintetikus vad típusú vagy mutáns

  14. FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK PROKARIÓTÁK E.coli ismert, Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl hidrofób - nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E.coli van szekréciós rendszere EUKARIÓTÁK • emlős sejtvonalak • minden fajta fehérje termeltethető bennük • tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek, • stabil expressziós rendszerek • hosszú, fáradságos optimalizálást igényel • élesztő • gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal, • sok ismeretanyag • viszonylag könnyű kezelhetőség • poszttranszlációs modifikációk lehetősége

  15. Escherichia coli • ELŐNYÖK  • óriási mennyiségű ismeretanyag • könnyű kezelhetőség, gyors növekedési sebesség, viszonylag olcsó médium • nagy mennyiségű biomassza gazdaságos előállítása • ismert szelekciós rendszerek • legtöbb expressziós rendszer • HÁTRÁNYOK  • általában nem szekretál • a sejten belül redukáló atmoszféra diszulfid hidakkialakulása gátolt • az eukariota poszttranszlációs módosítások általában nem megvalósíthatóak • nem alakul ki a megfelelő aktiv szerkezet, rossz folding

  16. STRATÉGIÁK TÚLTERMELTETÉSRE KONSTITUTÍV PROMÓTER INDUKÁLT TERMELTETÉS • a fehérje a teljes növekedési fázis alatt expresszálódik • nagy sejttömeg elérése után a fehérje visszanyerése • nem igazán használatos, toxicitási problémák miatt • a promoter represszált állapotban van a növekedés egy bizonyos fázisáig • valamilyen indukcióval derepresszió • további növesztés • fehérje visszanyerése • legáltalánosabban használt stratégia • toxicitás sok esetben megoldható

  17. TSZE PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI SZF GS  Pr -35 -10 SD kódoló szekvencia TT STOP kodon UAAU UGA UAG -10 -35 TTGACAN17TATAAT START kodon AUG GUG UUG 5’ UAAGGAGGN(3-11) AR ORI Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt

  18. transzkripció transzláció A génexpresszió szabályozása DNS RNS FEHÉRJE transzripciós szinten poszt-transzkcripciós szinten (mRNS degradáció, protein stabilitás,stb.)

  19. Különböző faktorok relatív hatása a fehérje termeltetésre E. coli-ban • Promóter indukálhatóság kb. 1000 x • Gazdasejt kb. 1000 x • A mRNS 5’ struktúrája kb. 100 x • Transzláció kb. 100 x • növekedési sebesség kb. 50 x(mRNS stabilitás)

  20. túltermeltetésnél: ne legyen nagyon magas a kópiaszám  toxikus fehérjék alapexpressziójának visszaszorítása “Runaway” plazmidok: indukálható kópiaszámú plazmidok

  21. TRANSZKRIPCIÓ • Iniciáció • fehérje termeltetés során a legfontosabb • Elongáció mivel a gén belsejében van, nem manipulálható • Termináció a transzkripció befejezése, a transzkripciós apparátus túlterhelésének elkerülésére

  22. NTD /` CTD CTD ? 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ A transzkripció iniciációja prokariótákban sigma faktor holoenzim RNS polimeráz RNS polimeráz alegységek: , `, , ,  promóter 5’ 3’ 3’ 5’ k1 k-1 Ha k1 >> k-1, akkor a polimeráz holoenzim nagyon erősen kötődik a promóter szekvenciához, a polimeráz nehezen tudja elindítani a polimerizációs reakciót. Tehát a transzkript mennyiségecsökken, habár in vitro a promóter és a holoenzim közötti kapcsolat erős. k2 k-2 3’ 5’ 5’

  23. 70 promoter szekvencia: -10 and -35 régiók

  24. A tökéletes70-függő promóter UP elem -35 Ext. -10 D +1 AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattA 14nt 4-6nt 4-6nt 17nt As70ismeri fel Az aalegység kötődik

  25. Bakteriális  faktorok

  26. Különböző gének expresszióját különböző szigma faktorok befolyásolják tápelvonás, Stressz, Vasra éheztetés, sejtsűrűség, Felületi adházió Transzkripciós faktorok (Szigma) gén expresszió változás  Morfológiai & fiziológiásváltozások   Adaptáció / Védekezés

  27. Két  faktor felépítése

  28. Enzim aktivitás mérés Western blotfehérje detektálása fehérje érése Riportergén riporter fehérje aktivitás  promóter aktivitás mRNS detektálása transzláció transzkripció A vizsgált operon promóter A génexpresszió tanulmányozása különböző módszerekkel különböző szinteken

  29. ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) I. • más néven gél retardációs assay • a DNS-t, amely feltételezhetően fehérjét köt, megjelöljük • jelölés lehet végen, szálon belül, egyszálon, kétszálon, kötési kísérletben a DNS kétszálú! • a DNS ne legyen től hosszú 20-200 bp, minél hosszabb a DNS, annál több nem specifikus reackió történik • lehet tiszta fehérje vagy fehérje populáció Natív poliakrilamid gél-: fehérje nélkül, +: fehérjével összekeverve DNS - + - + jelölés DNS kötő fehérje nem kötődik kötődik összekeverés - + nem kötődik kötődik nem specifikusan kötődik

  30. ELECTRO MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) II. • a mobilitás eltolódás inkább a komplex méretét jellemzi, a kölcsönhatás errősségét nem • a kölcsönhatás erősségét a nem kötöt DNS, és a kötésben levő DNS jelének intenzitása jellemziminél kevesebb fehérje okoz erős jelet az eltolódott sávban annál erősebb a kölcsönhatás SUPERSHIFT ASSAY titrálás fehérje mennyiségre • ha van tippünk, hogy milyen fehérje kötődik • és van rá specifikus ellenanyagunk hozzáadott fehérje mennyiség nő  - + nem kötődik kötődik ellenanyag is kötődik - + ++ a DNS - fehérje kölcsönhatás erősségéről ad felvilágosítást, nem a képződött mRNS mennyiségéről -: fehérje nélkül, +: csak fehérje hozzáadása, ++: fehérje és ellenanyag hozzáadása

  31. * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNázI DNázI FOOT PRINT I. DNS hossz 100 – 200 bp DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan mind a két jelölt szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis Maxam-Gilbert létra DNázI hasítás G A+G C+T C D *

  32. * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNázI FOOT PRINT II. DNázI hasítás-: fehérje nélkül+: fehérje jelenlétében Maxam-Gilbert létra G A+G C+T C D- D+ hiperszenzitív hely (HSH) DNázI HSH

  33. * * * * * * * * Me Me Me * * * * * * * * METILÁCIÓS INTERFERENCIA DNS jelölés szigorúan a végén, szálspecifikusan a DNS-t Maxam-Gilbert szerint dimetilszulfáttal (DMS) metiláljuk mind a két jelölt szállal meg kell csinálni a kötési kísérletben a DNS kétszálú denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis piperidinhasítás MeG-nél Maxam-Gilbert létra G A+G C+T C G G G G G piperidin DMS G G G Me G csak a jelölt szálon szemléltetve

  34. * * * * * * * * * * * METILÁCIÓS INTERFERENCIA II. piperidinhasítás MeG-nél Maxam-Gilbert létra modell: PM és NKmintázat K mintázat G A+G C+T C PM K NK tegyük fel, hogy ezek a G-k esszenciálisak a kötéshez DMS EMSA - +  K: kötött NK: nem kötött kivágás, izolálás piperidin hasítás   denaturáló PAGE PM: protein mentes

  35. MS? UV KERESZTKÖTÉS (CROSS LINKING) Ismeretlen DNS kötő fehérjék molekulatömegének becslésére 1. A DNS szálat szálon belül jelöljük, és Br-dUMP-t építünk be (a Br-dUMP nem zavarja a kötődést) minta marker : Br SDS-PAGE jelölt fehérje DNázI kezelés   EMSA UV fény kivágás, izolálás  a fehérje DNS komplex kötés kovalens lesz

  36. A mRNS mennyiségének meghatározása • Northern-blot és hibridizáció • reverz-transzkripció kapcsolt kvantitatív PCR • korrekt, de belső összehasonlító standardokat igényel

  37. transzkripcionálisan aktív sejt vagy sejtmagi extraktum + ATP, CTP, 32P-UTP, In vitro transzkripció RegulátorG mentes kazetta régió (3-400 bp) Promóter a képződött radioaktív RNS analizise denaturáló PAGE-n. csak a fenti 3-400 bp-os fragmentum fog látszani, a többi tartalmaz G-t  ezek transzkirpciója leáll mennyiségi becslés: denzitometriásan, vagy PhosphorImager-rel elsősorban transz szabályozó elemek hatásának vizsgálatára alkalmas

  38. Riporter gének alkalmazása Regulátor régió riporter gén (pl. lacZ) Promóter SEJT -galaktozidáz (LacZ) -galaktozidáz aktivitás mérés feltételezi, hogy nincs poszt-transzkripciós szabályozás, és az enzim specifikus aktivitása is minden mintára egyforma aktivitás mérés kiküszöbölése GFP: Green Fluorescent Protein, gerjesztve floureszkál a kapott aktivitást illetve szignált normálni kell a sejt vagy protein mennyiségére

More Related