ELEKTROFOREZ

1. ELEKTROFOREZ Etkin Kimyagerler Eğitimleri Faydalı olması dileğiyle… Yüksek Kimyager Hasan ÖZ

2. ELEKTROFOREZ • Elektroforez,doğru akımın uygulandığı bir tampon çözeltide yüklü taneciklerin diferansiyel göç hızlarına dayanan bir ayırma yöntemidir. Yüklü türlerin, içinden elektrik akımı geçirilen bir elektrolitte çözündükleri veya süspande olduklarında göç etmeleri esasına dayanır. • Kapiler Zone Elektroforez

3. Giriş • İletken bir çözelti içindeki yüklü/yüksüz parçacıkların veya moleküllerin bir elektriksel alan varlığında göç etmesi söz konusudur. • Elektroforez için dört şeye ihtiyac vardır: • iyonların hareket edebileceği uygun bir ortam (destek ortamı) • uygun pH’da bir tampon çözelti • elektriksel alanı oluşturmak icin doğru akım sağlayacak güç kaynağı • birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dedektör

4. Tarihçe Bu ayırma yöntemi ilk olarak İsveçli kimyacı Arne Tiselius tarafından serum proteinleri üzerinde çalışırken bulunmuş ve çalışma dolayı kendisi 1948'de Nobel Ödülü ile ödüllendirilmiştir. Elektroforezin kapilerde gerçekleştirilmesinin avantajları 1980’lerin başlarında Jorgenson ve Lukas’ın çalışmaları ile belirginleşmiştir.

5. 1897-Kohlrausch-elektrolit içindeki iyonların göçü • Hjerten–CZE terimi,1-3 mm iç çaplı kuartz kapiller • Virtanen-0,2-0,5 mm iç çaplı kapiller • Everaertsve Hoving–Keulemans-politetrafluoroetilen kapiller(0,5 mm ID) organik asitlerin isotakoforetik ayrımları • Jorgensonve Lukacs-75 μm ID açık cam kapiller • Terabe-Kapiller elektrokinetik kromatografi • Microphoretic Systems,Applied Biosystems, Beckmann, Bio-Rad Laboratories, Spectrovision.

6. Ayrılma bileşiklerin; • Yük/kütle oranına göre, • Afinitilerine göre, • Partikül büyüklüklerine göre, • Hidrofobik özelliklerine göre, • Absorbsiyon özelliklerine göre gerçekleşir.

7. ELEKTROFORETİK AYIRMALARIN TEMELİ İYON GÖÇ HIZI v= µe E

8. v= µe E eşitliğinden çıkarılanlar: • Elektroforetik hareketlilik analitin iyonik yükü ile doğru ve sürtünmeli geçiktirme katsayısı ile ters orantılıdır. • Elektrik alan sadece iyonlar üzerine etkilidir.Nötral türler birbirinden ayrılamazlar. • Eğer iki farklı tür hem farklı iyon yüküne ve hem de tampondan geçerken farklı sürtünme kuvvetine sahipse,bu iki madde birbirinden ayrılabilir. • Analit iyonun sürtünmeli geçiktirme kuvveti ,o iyonun boyutuna,şekline ve içinde göç ettiği ortamın viskositesine bağlıdır.

9. Elektroforetik ayırmanın temelleri • Aynı boyuttaki iyonlar için;yük ne kadar büyükse,yürütücü kuvvet ve göç hızı o kadar büyük olur. • Aynı yükteki iyonlar için ise ,iyon küçüldükçe sürtünme kuvveti küçülür ve göç hızı artar. • İyonun iyon/yük oranı bu iki etkiyi birleştirmektedir. Kromatografinin aksine elektroforetik ayırmada tek faz söz konusudur.

10. ELEKTROFOREZ TİPLERİ

11. Klasik Yöntemler Kağıt ve Selüloz Asetat Elektroforezi Kağıt tampon çözelti ile doyurulduktan sonra, iki ucu tampon çözeltiye batacak şekilde gerilir. Örnek madde kağıt üzerine genellikle bir çizgi halinde sürülür. Kurumaması için kağıt hem üstten kapatılır hem de bir su deposu üstünde tutulur. Gerilim uygulandıktan sonra bir süre bekletilir, süre tamamlandığında kağıt çıkartılır, kurutulur ve analiz edilir.

12. Kağıt ve selüloz asetat elektroforezi Kağıt ve selüloz asetat elektroforezi Yüksek voltajlı kâğıt elektroforezi en çok peptitler ve aminoasitlerin ayırt edilmelerinde kullanılmaktadır.Selüloz asetat elektroforezi ise öncelikle serum proteinlerinin elektroforezinde önemlidir. Jel Elektroforezi -Poliakrilamid Jel Elektroforezi: PAGE; serum proteinlerinin, proteinlerin genetik varyasyonlarının ve izoezimlerin analizinde en iyi sonuç veren elektroforez tipidir. Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez, örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmasına yol açar. Çünkü ayırım hem moleküler elekleme, hem de elektroforetik harekete dayanır.

13. Jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamid ve bis akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır.İki maddenin polimerizasyonu ile jelde porlar olusur. Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı moleküllerin analizi yapılabilir.Yüksek konsantrasyonlarda ise kücük porlar oluşur ve düşük molekül ağırlıklı moleküllerin analizi yapılır.

14. Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta(0,5-2,0 mm) tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da 10-10 cm boyutunda hazırlanır. Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar.Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır. Kuyucuklar, tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere, tamponla yıkanır. Jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;kuyucuklara örnekler konulur ve akım geçirilir.Uygun boya ile boyanır.

15. Agaroz Jel Elektroforezi Serum proteinleri, hemoglobin varyantları, LDH izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonları ve diğer maddelerin analizi için başarıyla uygulanmaktadır. Agaroz sıcak suda çözünür, soğutulduğu zaman, karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Örnekler, jel içine yapılan küçük kesilerle oluşturulan kuyucuklar içerisine uygulanırJelin uçları daha sonra içine elektrodlar yerleştirilmiş ayırıcı tampon tankına daldırılır.Elektrodlar arasında bir akım oluşturan bir voltaj uygulanır. Jelden geçen bu akım genellikle 30 dakika civarında sürer ve istenen rezolüsyonu sağlar. Tamponun iyonik gücü akım miktarını ve sabit bir voltajda proteinlerin hareketini sağlar. Eğer iyonik güç azsa nispeten daha çok akım yüklü proteinler tarafından taşınır.

16. İyonik güç fazlaysa daha az akım daha kısa mesafeye hareket eden proteinler tarafından taşınır. Jelin iletken tamponla teması düzensizse akım elektrodlar arasında farklı olabilir, proteinler daha fazla akım olan yöne daha çok göçer. Elektroforez süresi çok uzun tutulacak olursa proteinler jelden tampon iç içe göçer. Elektroforezden sonra jel asetik asit gibi hafif bir fiksatifle muamele edilir ve proteinler göç ettikleri yerlerde çökerler. Daha sonra boyanır, jel kurutulur ve zemini açılır.

18. KAPİLER ELEKTROFOREZ

19. KAPİLER ELEKTROFOREZİN AVANTAJLARI

20. KAPİLER ELEKTROFOREZDE AYRIMI GERÇEKLEŞTİRİLEBİLEN MOLEKÜLLER

21. KAPİLER ELEKTROFOREZDE GÖÇ HIZLARI VE TABAKA YÜKSEKLİKLERİ • v= µe E eşitliğinde görüleceği gibi,bir iyonun göç hızı(v), elektrik alanın şiddetine bağlıdır.Elektrik alanı ise;uygulanan potansiyelin büyüklüğüne(V,volt) ve uygulandığı kapilerin uzunluğu L'ye bağlıdır. Bu eşitlik,istenilen hızlı iyonik göçü ve hızlı ayırmayı sağlamak için ,yüksek bir potansiyelin uygulanmasının gerekli olduğunu gösterir. Hızlı ayırma istenilmekle birlikte ,daha önemlisi daha yüksek bir ayırma gücü elde etmektedir. • Uygulanan potansiyel (V) arttıkça iyonun göç hızı artar. • Kapiler uzunluğu arttıkça göç hızı azalır.

22. KAPİLER ELEKTROFOREZDE TABAKA YÜKSEKLİKLERİ D: cm2 s-1 cinsinden çözünen maddenin difüzyon katsayısıdır. Tabaka sayısının artmasıyla ayırma gücü arttığından,istenilen yüksek-ayırmalı ayırmaları başarmak için yüksek bir potansiyel uyugulanması gereklidir.Elektroforezde tabaka sayısı,kromatografinin aksine kolonun uzunluğu ile artmamaktadır. Kapiler elektroforez normalde; 10000 ile 200000 aralığında tabaka sayısına sahipken ,HPLC'de ise bu sayı 5000 ile 20000 arasındadır.Amino asit için kapiler zon elektroforez yöntemi ile 3000000 tabaka sayısına ulaşılırken,polinükleotidlerin kapiler jel elektroforez yöntemi için 10000000 tabaka sayısına ulaşıldığı literatürlerde yer almaktadır.

23. ELEKTROOSMOTİK AKIŞ Elektriksel olarak oluşturulan çözelti akışıdır. Erimiş silika kapilerin iç duvarları silanol (Si-OH) grupları içerir.Bu gruplar yüksek pH’lı bir elektrolit çözeltisi ile temas ettiğinde iyonize olur. Erimiş silikanın iç yüzeyi Silanol gruplarının dissosiasyonu

24. Bu dissosiasyon kapileri eksi yüklü hale getirir. Dissosiasyon sonucu eksi yük kazanmış kapiler iç yüzeyi. Elektronötraliteyi korumak için bu eksi yük üzerine çözeltideki katyonlar çekilerek çift tabaka oluşur Kapiler iç yüzeyinde çift tabaka oluşumu.

25. Bir gerilim uygulandığında bu katyonlar ve onların etrafında yani solvatize durumdaki su veya çözücü molekülleri katoda doğru hareketlenir. İyonların ve onların beraberindeki su moleküllerinin bu hareketi elektroosmotik akışadını alır Bu akış tüm çözünenenleri genellikle dedektöre doğru kapiler boyunca etkin bir şekilde pompalar. Kapiler elektroforez ayırma sisteminde elektroosmotik akışın gösterilişi.

26. EOA’ın kapiller duvarnda gerçekleştiğini gösteren şema

27. Elektroosmotik hareketlilik eo =  / 4  r veo = eo V/L

28. Zeta potansiyeli, kapiler duvarındaki asidik silanol gruplarının iyonizasyonu ile belirlenir. EOF elektrolit pH’ına büyük ölçüde bağlıdır. pH 4’ün altında iyonizasyon çok küçüktür. Bu durumda EOF hızı önemsizdir. pH 9’un üzerinde silanol grupları tamamen iyonlaştığı için elektroosmotik akış kuvvetlidir. Artan elektrolit derişimi zeta potansiyelini düşürdüğünden EOF hızını azaltır.

29. EOF kapiler boyunca her noktada sabit akış hızı üretir. Bunun anlamı elektroosmotik akışın düz kesitli bir akış oluşturmasıdır. Elektroosmotik akış kesiti Bu akış profili, HPLC gibi çözücünün pompalandığı sistemlerde karşılaşılan, sürtünmeden dolayı kolonun kenarlarında daha yavaş, orta kısmında ise daha hızlı bir kesit oluşturan laminar akışa göre bir avantajdır.

30. Hidrodinamik akış kesiti Laminar akıştaki homojen olmayan hız dağılımı pik genişlemesine sebep olur. Kapiler elektroforezde bileşenlerin ayrılması her bir türün elektroforetik hareketlilikleri ile elektroosmotik hareketliliğin toplamına göre oluşur. v = (e + eo) V/L e = Elektroforetik hareketlilik (Her bir iyonun karşıt yüklü elektroda doğru hareketi) V = Uygulanan gerilim

32. Ayrıma Etki Eden Faktörler Tampon Çözelti Seçimi Tampon çözeltinin cinsi ayrılacak iyona ve matriks iyonlarına bağlı olarak değişmektedir.Uygun tampon çözelti kullanılmadığında girşimler artmakta ve istenilen elde edilmemekte veya pik genişlemesi gözlenmektedir.

33. Tampon çözelti derişimi Tampon konsantrasyonu arttıkça;sabit faz ile etkileşime giren iyonların elektroforetik mobilitelerinde azalma meydana gelmekte,bu yüzden kapilerde kalma süresi artmaktadır.

34. pH Etkisi pH arttıkça iyonizasyonla birlikte analit-sabit faz etkileşimleri artacağından alıkonma zamanları da artacaktır.

35. Sıcaklık Etkisi Sıcaklık arttıkça viskosite azalır.Dolayısıyla ; eo =  / 4  rformülü gereği eo artacağından alıkonma zamanın azalır.

36. Uygulama Voltajının Etkisi: Uygulama voltajı arttıkça; veo = eo V/L formülü gereğince ,elektroosmotik akış hızı artacağından; alıkonma zamanı azalmaktadır. Viskosite Etkisi: Viskosite arttıkça;eo =  / 4  rformülü gereği eo azalacağından ilgili alıkonma zamanı da artacaktır.

37. ELEKTROFORETİK AYIRMA

38. KAPİLER ELEKTROFOREZDE PİK BANT GENİŞLEMESİ Klasik elektroforezde hızlı ayırma sağlamak için yüksek gerilim uygulanması bant genişlemesine yol açar. CE’de kapiler yüzeyinden ısının kolay uzaklaştırılabilmesi nedeniyle pik genişlemesi gözlenmez. HPLC’de laminar akış bant genişlemesine neden olur. CE’de düz kesitli elektroosmotik akış etkin olduğu için pik genişlemesi gözlenmez. HPLC’de pikler ayrılma sonrası kolon ucundan dedektöre aktarılırken karışma sonucu pik genişlemesi olabilir. CE’de dedeksiyon kapiler üzerinde gerçekleştiği için pik genişlemesi sorunu olmaz. CE’de moleküler difüzyon ve örnek enjeksiyonu yönteminden ileri gelen pik genişlemeleri olabilir.

39. KAPİLER ELEKTROFOREZ İÇİN CİHAZ 10-100 µm iç çap ve 40-100 cm uzunluğunda,tamponla doldurulmuş erimiş silika kapiler ,içinde platin elektrotlar bulunan iki tampon haznesi arasına yerleştirilmiştir.Numune bir uçtan verilirken ayrılan maddeler diğer uçta tayin edilir.Yüksek potansiyelli güç kaynağının kutubu gösterildiği gibi olabilir veya anyonların hızlı ayrılmasını sağlamak için ters çevrilebilir.

40. ALET BÖLÜMLERİ KAPİLER Dışı poliimit koruyucu kılıf ile kaplanmış erimiş silika kapilerler kullanılır. 25-75μm iç çapında, 30-100 cm boyunda olanlar en sık kullanıllanlardır. Kapilerin iç yüzeyi, kapiler duvarında farklı maddelerle kovalent bağlanmak suretiyle kimyasal olarak değiştirilebilir. Kararlı ve iyi ayırmalar yapabilmek için kapiler çevresinin sıcaklığını düzenlemek önemlidir.

41. Tamponlar Sitrat, borat, asetat, fosfat ve TRIS tamponları sık kullanılan tamponlardır. KAPİLERİN YIKANMASI • Fused silika kapiler için: • *1 N NaOH • *0.1 N NaOH • *Distile su *Çalışma elektroliti • Organik çözücü ve kuvvetli asit Voltaj: 10-30kV

42. NUMUNE VERME En yaygın numune verme yöntemleri,elektrokinetik enjeksiyon ve basınç enjeksiyonudur.

43. DEDEKTÖR HPLC'de kullanılan tüm dedektörler burada da kullanılabilir. Bir UV dedektörü

44. Absorbans dedektörleri Absorbans ölçümlerinin duyarlılığını arttırmak için,ölçüm yapılan ışın yolunun arttırılması gibi bazı teknikler ileri sürülmüştür

45. Direk UV dedeksiyonu İndirekt UV dedeksiyonu FLORESANS İLE TAYİN:.Yoğun ışın kaynağından faydalanarak gözlenebilme sınırlarını düşürmek amacıyla,küçük kapilerde uyarıcı ışını odaklamak için lazerli cihazlar tercih edilmektedir.Lazerli floresans tayin yöntemi kullanılarak,10 zeptamol veya 6000 molekül tayin edilebilmiştir.

46. Kütle Spektrofotometresinin dedektör olarak kullanımı

47. -FLORESANS İLE TAYİN: Floresans yapan analitlerin veya türevlerinin duyarlılık ve seçiciliğinin artmasına yol açar.Yoğun ışın kaynağından faydalanarak gözlenebilme sınırlarını düşürmek amacıyla,küçük kapilerde uyarıcı ışını odaklamak için lazerli cihazlar tercih edilmektedir. -ELEKROKİMYASAL TAYİN: İki çeşit elektrokimyasal dedektör kullanılmaktadır:iletkenlik ve amperometri. Elektrokimasal dedektörler ilgili problemlerden biri ayırmada kullanılan yüksek potansiyelden dedektör elektrotların izole edilmesidir.İzolasyon için kullanılan yöntemlerden biri,dedektör kısmının bulunduğu kapiler ile diğer kapiler arasına gözenekli cam veya grafit gibi gözenekli bağlantının eklenmesidir.

48. KAPİLER ELEKTROFOREZİN UYGULAMALARI KAPİLER ZONE ELEKTROFOREZ Ayırma çözünendeki asidik grupların pH kontrollü dissosiasyonuna veya çözünendeki bazik grupların pH kontrollü protonlanmasına dayanır. İyonik türler yük/büyüklük oranlarındaki farklılıklara dayanarak ayrılır. Nötral bileşenler ayrılmadan dedektöre birlikte sürüklenir.

49. Uygulanan potansiyel ile karışımı oluşturan parçacıklar kendi iyonik hareketliliklerine göre zonlara ayrılırlar Çözünenin tüm kapiler boyunca göç etmesi için gereken zaman (t), kapiler uzunluğu (L) ile elektroosmotik ve elektroforetik hızların her ikisine bağlıdır. Ayırma hızını artırmak için kapiler boyunca yüksek gerilim uygulamak gerekir. Yüksek sıcaklıklarda tampon çözelti daha az viskozdur ve örnek iyonları elektroda doğru hareket ederken daha az dirençle karşılaştıklarından daha hızlı göç ederler.

50. Türlerin hareketliliği iyonu kompleksleştirmek suretiyle de değiştirilebilir. Elektroosmotik akış varlığı katyonların ve anyonların tek bir analizle ayrılmasını ve tanınmasını sağlar. Bir çözünenin tüm göç etme zamanı çözünenin hareketliliği ve elektroosmotik akışın her ikisi ile de ilgilidir. Görünen hareketlilik elektroforetik ile elektroosmotik hareketliliklerin toplamına eşittir.