酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）病原生物学实验室 ( 免疫）任书荣

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）病原生物学实验室(免疫）任书荣

一、实验目的 • 掌握ELISA的原理及方法

二、principle：  • 抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍保持其活性；抗原或抗体与酶交联成酶标抗原或抗体后，仍分别保持其免疫活性和酶活性。 • 酶标抗原或抗体与相应抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时，可以催化底物的水解、氧化或还原，从而产生有色物质。颜色反应的深浅与相应抗体或抗原量相关。 • 常用的ELISA方法包括：间接法、双抗体夹心法、竞争法等。

ELISA双抗体夹心法(sandwich assay)测甲胎蛋白（α-fetal protein, AFP）

一、Principle of AFP detection • 用抗AFP抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中的AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗AFP抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应AFP的量呈正相关。

抗AFP-E 待测AFP E E E +S 显色 AFPAb包被固相载体 principle

双位点一步法：抗AFP不同位点的McAb 抗AFPMcAb抗体 AFP 抗AFPMcAb抗体

二、material 1、AFP检测试剂盒 2、AFP参考标准夜（0、25、50、100、200、400ng/ml）。 3、DW 4、终止液（2M H2SO4）。 5、酶标测定仪、37℃温箱。 6、微量加样器、滴管、吸水纸等。

三、method （一）quantity test 1、add sample 取包被好的酶标孔7孔，进行标记，第1－6孔分别加入AFP参考标准夜（0、25、50、100、200、400ng/ml）各50ul。第7孔加入样品50ul。 2、每孔加酶结合物1滴，37℃15分钟。 3、wash 在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干. 4、显色每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，加入2M H2SO4 100ul终止反应。 5、酶标仪450nm比色，计算结果。

（二） quality test 1．Add sample • 取包被好的酶标板3各孔，分别加入阴性对照（20 ng/ml）、阳性对照（400 ng/ml）和待检标本各50ul，各孔再加入酶结合物1滴, 37℃15分钟。 2、washing 在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干. 3、add chromogen 每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，观察结果。

四、result 1．Quantity test • 用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，AFP含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出相应标本的AFP含量。 2．Quality test • 在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔则AFP>400ng/ml，阳性；若待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则20ng/ml＜AFP＜400ng/ml，弱阳性；待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则AFP ＜20ng/ml，阴性。 • 参考范围：正常成人AFP含量＜20ng/ml。

五、Report 1．简述ELISA原理及ELISA双抗体夹心法测AFP原理。 2．记录实验结果。

酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）病原生物学实验室 ( 免疫）任书荣