Ottimizzazione dell’agrotecnica della canapa ( Cannabis sativa L.) per applicazioni di tipo farmaceutico.

1. Dipartimento Agronomia Ambientale e Territoriale Istituto Sperimentale Colture Industriali - Sez. Rovigo Ottimizzazione dell’agrotecnica della canapa (Cannabis sativa L.) per applicazioni di tipo farmaceutico. Relatore: Prof. Dario Giambalvo Tesi di laurea di: Correlatori: Salvatore Casano Dott. Giampaolo Grassi Dott. Piero Trapani

2. La canapa è stata ampiamente coltivata sin dall’antichità L’Italia, agli inizi del XX secolo, era il maggior produttore (circa 100.000 ha) di fibra e seme di canapa in Europa L’attuale superficie nel mondo investita a canapa (da fibra e da seme) ammonta a circa 75.000 ettari (in Italia poco più di 1.000 ettari) Attuale rivalutazione della canapa in virtù delle sue molteplici utilizzazioni

3. Utilizzazioni • Fibra • Cellulosa • Solventi, vernici, saponi, lubrificanti, materie plastiche • Biodiesel • Cibo (per consumo umano e per l’alimentazione zootecnica) • Integratori alimentari • Biomassa da energia • Oli essenziali • Applicazioni farmaceutiche

4. A:Patologie per le quali esistono evidenze incontrovertibili: • Trattamento della nausea in chemioterapia • Stimolazione dell’appetito in pazienti con sindrome da deperimentoAids–correlata B:Patologie per le quali esistono promettenti evidenze preliminari: • Terapia del dolore • Effetti neuroprotettivi e antiossidanti (ictus e traumi cranici) • Sindrome di Gilles de la Tourette • Glioblastomi • Artrite reumatoide • Glaucoma • Epilessia • Sclerosi multipla (sollievo da dolore neuropatico) POTENZIALI CAMPI DI IMPIEGO TERAPEUTICO DEI DERIVATI DELLA CANAPA

5. il SATIVEX® è il primo farmaco contenente cannabinoidi ottenuti da estratti vegetali ad essere accettato dalla farmacopea ufficiale di un Paese occidentale Spray sub-linguale a % standardizzata di Δ9-THC e CBD Δ9-THC/CBD 1:1 E’ ottenuto dopo estrazione chimica, purificazione e titolazione di due varietà “monochemiotipiche”: una ricca in Δ9-THC e l’altra in CBD; entrambe sono caratterizzate da un elevato grado di purezza (circa 95 %) del cannabinoide principale rispetto ai secondari

6. POTENZIALI CAMPI DI IMPIEGO TERAPEUTICO DEI DERIVATI DELLA CANAPA C:Patologie in cui esistono evidenze meritevoli di ulteriori approfondimenti: • Terapia dei tumori • Lesioni midollari (tetraplegia, paraplegia) • Malattie neurodegenerative (distonie, Parkinson, Huntington, Alzheimer) • Asma bronchiale • Malattie autoimmuni e patologie infiammatorie croniche (lupus eritematoso, morbo di Crohn, colite ulcerosa, etc.) • Sindromi ansioso–depressive e altre sindromi psichiatriche • Patologie cardiovascolari • Sindromi da astinenza nelle dipendenze da sostanze • Prurito intrattabile

7. Gli effetti terapeutici della canapa sono dovuti alla presenza di p.a. appartenenti alla famiglia dei cannabinoidi (gruppo di composti a 21 atomi di C unicamente prodotti dal genere Cannabis); ad oggi ne sono stati identificati oltre 60, comprendendo anche i loro acidi carbossilici, analoghi e prodotti di trasformazione I cannabinoidi più abbondanti nei tessuti vegetali sono: • Δ9-THC(delta9-tetraidrocannabinolo) • CBD (cannabidiolo) • CBC (cannabicromene) • CBG(cannabigerolo) • Δ9-THCV, CBDV e CBGV(omologhi propilici) Il CBG è il precursore di tutti i cannabinoidi e, per via enzimatica, viene convertito negli altri cannabinoidi principali

8. Il Δ9-THC è il cannabinoide più studiato per gli effetti terapeutici, ma è dotato di attività psicotropa psicotropo semi-psicotropo Classificazione dei fenotipi in base al contenuto in cannabinoidi % Δ9-THC non psicotropo 0,0 2,0 1,0 0,5 1,5 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 0,5 1,0 % CBD Il CBD modula l’attività del Δ9-THCattenuandone gli effetti collaterali e prolungandone l’effetto terapeutico

9. L’Istituto Sperimentale Colture Industriali Sezione Operativa Periferica di Rovigo da alcuni anni si occupa di selezionare varietà di canapa monoiche elinee monochemiotipiche

10. Obiettivi della ricerca • acquisire informazioni sulle principali caratteristiche di • genotipi di canapavalutandone il comportamento in termini di parametri biometrici e, soprattutto, di concentrazioni % in cannabinoidi al variare di alcuni aspetti dell’agrotecnica CBD e CBG Δ9-THC esenti • acquisire informazioni sulle variazionidelcontenuto % in cannabinoidi nelle foglie durante il ciclo biologico della coltura

11. MATERIALI e METODI 4 pacchetti di coltivazione(substrato + concimazione) L’attività di ricerca è stata articolata in due distinte prove: previamente e regolarmente autorizzate dal Ministero ai sensi dell’ art. 26 D.P.R. n° 309/90 (coltivazione di canapa a scopi sperimentali) PROVA 1: 20 linee inbred PROVA 2: 2 progenie clonali

12. Pacchetti di coltivazione in valutazione Substrato: mix di vari tipi di torba (in prevalenza torba nera) Concimazione: minerale (in prevalenza azotata in fase vegetativa e fosfo-potassica in fase di fioritura) T1 Substrato: fibra di cocco Concimazione: formulati minerali specifici forniti dalla ditta produttrice (Coco A e Coco B) T2 Substrato: torba bianca e compost di cortecce Concimazione: formulati minerali specifici forniti dalla ditta produttrice (Terra Vega – f. vegetativa e Terra Flores – f. fioritura) T3 Substrato: torba bianca e compost di cortecce Concimazione: formulati organici specifici forniti dalla ditta produttrice (Bio Vega – f. vegetativa e Bio Flores – f. fioritura) T4

15. Prova 1 – Linee inbred Sito: Monselice (PD) - presso una serra dell’Istituto Tecnico Agrario “Kennedy” Periodo: dal 2 agosto al 18 ottobre 2004 Semina: il 2 agosto in cubetti di torba pressata N° piante:200 totali - 50 per trattamento Trapianto: dopo una settimana circa in vasi da 5 litri precedentemente invasati con i rispettivi substrati Illuminazione: dal trapianto fino al 14/9 (fase vegetativa): 18 ore di luce dal 14/9 alla raccolta (fase riproduttiva): 11 oredi luce Irrigazione: interventi giornalieri per mantenere il substrato sempre in condizioni prossime alla CIC Raccolta: il 18 ottobre (15-20 giorni d’anticipo rispetto al presunto ottimale)

16. Prova 2 – Progenie clonali Sito: Rovigo - presso una serra dell’Istituto Sperimentale per le Colture Industriali Periodo: dal 4 ottobre 2004 al 14 gennaio 2005 N° piante:68 (24 clone E1 e 44 clone E7) - 17 per trattamento Trapianto: il 4/10 in vasi da 2 litri precedentemente invasati con i rispettivi substrati Illuminazione: dal trapianto fino al 2/11 (fase vegetativa): 18 ore di luce dal 2/11 alla raccolta (fase riproduttiva): 11 oredi luce Irrigazione: interventi giornalieri per mantenere il substrato sempre in condizioni prossime alla CIC Raccolta: il 14 gennaio 2005

17. Rilievi (a maturazione) • Altezza delle piante • Diametro del fusto • Biomassa epigeica complessiva e ripartita nelle sue componenti (fusto, foglie, infiorescenze) • Determinazione del contenuto in cannabinoidi nelle infiorescenze mediante analisi gas-cromatografica [L’estrazione è stata effettuata seguendo i metodi ufficiali UE (Reg. 796/2004); solvente (n-esano) e standard interno (squalene)]

20. Prova 1 – Linee inbred

21. Prova 1 – Linee inbred

22. Prova 1 – Linee inbred

23. Prova 1 – Linee inbred

24. Prova 1 – Linee inbred

25. Prova 1 – Linee inbred

26. Prova 1 – Linee inbred

29. Prova 2 – Progenie clonali

30. Prova 2 – Progenie clonali

31. Prova 2 – Progenie clonali

32. Prova 2 – Progenie clonali

33. Prova 2 – Progenie clonali

34. Conclusioni • E’ stata riscontrata una ampia variabilità tra le linee in esame, che peraltro hanno mostrato una notevole stabilità di risposta al variare dei trattamenti applicati • Sono state individuate linee stabili nel profilo chemiotipico e con elevato contenuto in CBD e CBG • Le % in cannabinoidi più elevate sono state realizzate con i “trattamenti” caratterizzati da un limitato apporto di elementi fertilizzanti • Il contenuto in percentuale in cannabinoidi si riduce progressivamente all’aumento della produzione di infiorescenze per pianta

35. Conclusioni • Dal confronto tra le tesi T3 e T4, caratterizzate da uguale substrato ma da differenti tipologie di concime utilizzato, rispettivamente minerale ed organico, emerge come la produzione in CBD per pianta non è variata in modo significativo tra i due trattamenti • La ricerca ha inoltre messo in evidenza un graduale decremento delle concentrazioni percentuali in cannabinoidi nelle foglie con il progredire della fase riproduttiva; ciò è presumibilmente collegato ai processi di senescenza delle foglie ma potrebbe anche essere legato a processi di traslocazione dei metaboliti verso le infiorescenze. Tale aspetto meriterebbe ulteriori approfondimenti sperimentali