Инициация трансляции у эукариот

1. Инициация трансляции у эукариот Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции

2. Особенности мРНК

3. Особенности инициаторной тРНК Инициаторная тРНКМет по структуре отличается от других тРНК • Прокариоты • N-формил-метионил-тРНК-f (F-Met-tRNAf) (аминогруппа блокируется – тРНК не может участвовать в элонгации) • Эукариоты • Не формилируется

4. Инициация: как рибосома оказывается на AUG-кодоне Эукариоты Прокариоты • Инициация может происходить как недалеко от 5’-конца, так и в середине мРНК со стартового кодона (обычно AUG) • 30S связывается непосредственно с сайтом инициации • Пуриновая SD-последовательность комплементарно спаривается с 16S рРНК -> ассоциация 30S субчастицы с мРНК • Белок S1 связывается с мРНК перед SD • 3 способа инициации: • Модель сканирования: взаимодействия малой субъединицы с кэпом и сканирование 5’UTR • Инициация на внутренних AUG-кодонах • Реинициация (после освобождения полипептида рибосома не диссоциирует)

5. Инициация: прокариоты • Отличительная особенность: • Сначала 30S связывается с мРНК в районе старт-кодона, • затем к комплексу присоединяется тРНК. • Факторы инициации: • IF-1 – стабилизация инициаторного комплекса • IF-2 + GTP – присоединение к комплексу инициаторной тРНК • IF-3 –препятствует ассоциации рибосомы, препятствует узнаванию не AUG-кодона

6. Инициация: эукариоты Прокариоты Эукариоты Обеспечивают активную конформацию малой субчастицы, посадку тРНК в Р-участок Объединение большой и малой субчастиц, ГТФ-азы П: Присоединение Мет-тРНК к 30S Препятствуют инициации с не AUG-кодона Тройной комплекс, имеет высокое сродство к 40S. После гидролиза GTP сродство теряется, фактор eIF2 и GDP отделяются. Стимулирует гидролиз ГТФ в тройном комплексе Площадка для связывания многих других факторов

7. Инициация: эукариоты

8. Инициация у эукариот на внутренних старт-кодонах • IRES – internal ribosomal entry sites • Обеспечивают внутреннюю инициацию на некоторых мРНК эукариот (в основном используются вирусами) • Относительно большие и сложные структуры (в отличие от SD-последовательностей прокариот) • Механизм действия: связывание компонентов транскрипционного аппарата • Примеры: • Пикорнавирусы (полиовирус, вирусы гепатита А, простого насморка, ящура) • Связывают 4G, не требует 4E • HCV (вирус гепатита C) • Связывает 40S, не требует 4F • CrPV (вирус паралича сверчка) • Связывает 80S, не требует никаких факторов

9. Инициация у прокариот • Что влияет на эффективность: • Степень комплементарности и длина последовательности SD • Вовлечение инициаторной последовательности во вторичные и третичные структуры • Регуляция: • Репрессия за счет белков, связывающихся с инициаторными районами • Вторичная структура может усиливаться связыванием с белками или низкомолекулярными лигандами • Riboswitches – связывают низкомолекулярные лиганды (витамины, нуклеотиды и т.п.), производящие «переключение» между различными вторичными структурами

10. Регуляция инициации: эукариоты • ФосфорилированиеeIF2 • Связывание eIF4E белком 4E-BP • С помощью белков, связывающихся с 5’UTR и блокирующих сканирование (На примере регуляции мРНКферритина белком IRE-BP) • С помощью белков, связывающихся с 3'UTR • С помощью микроРНК мРНК-специфическая регуляция (засчет регуляторных белков или некодирующих РНК, которые связываются с мРНК) Глобальная регуляция(модуляция активности основных факторов инициации)

11. Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляция (1). ФосфорилированиеeIF2 • Фактор eIF2 входит в состав тройного комплекса • Комплекс участвует в выборе инициирующего кодона • В ответ на различные условия стресса одна из 4 киназ фосфорилирует альфа-субъединицу фактора eIF2 по Ser51 • Фосфорилированный eIF2 – ингибитор для eIF2B (за счет слишком плотного связывания) • Не происходит реактивации комплекса • При узнавании инициаторного кодона: eIF2*GTP -> eIF2*GDP + Pi • eIF2*GDP не имеет сродства к рибосоме -> отщепляется • eIF2*GDPнеобходимо реактивировать (eIF2B – guaninenucleotide-exchangefactor)

12. Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляция (1)Противоположное действие фосфорилированного фактора eIF2 • GCN4 мРНК в дрожжах • Кодируемый белок является транскрипционным активатором генов, регулирующих биосинтез аминокислот • Имеет 4 короткие ORF ближе к 5’-концу от инициаторного кодона GCN4 • Трансляции GCN4 начинается благодаря реинициации

13. Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляция (2). Связывание eIF4E • eIF4E в составеeIF4F связывается с кэпом, в результате чего комплекс связывается с мРНК • eIF4E-binding proteins (4E-BPs) в дефосфорилированной форме конкурируют с eIF4G за связывание с eIF4E -> • 4E-BPs ингибируют кэп-зависимую трансляцию General 4E-BPs мРНК-специфичные 4E-BPs

14. Регуляция инициации: эукариотыГлобальная регуляцияОбщая схема

15. Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляция Белки, связывающиеся с 5’UTR (Регуляция мРНК ферритина белком IRE-BR) • Наиболее изученный механизм • мРНК кодирует белок ферритин, отвечающий за связывание излишков железа в клетке. При малом количестве железа вреден. • IRE – iron-responsing elements – области мРНК, участвующие в регуляции • IRP - IRE regulatory proteins – регуляторные белки (IRE-BP) • При недостатке железа IRP связываются со шпилькой IRE в 5’UTR • Блокирует сканирование 5’UTR

16. Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляцияБелки, связывающиеся с 3’ UTR • На примере мРНК церулоплазмина • Репрессируется интерфероном-гамма (IFNγ) • Фактически ингибитором является сложный комплекс GAIT. Один из составляющих его белков – L13а из 60S • IFNγ индуцирует фосфорилированиеL13а -> этот белок высвобождается из 60S и присоединяется к GAIT • GAIT-комплекс связывается с GAIT-элементом в 3’UTR и блокирует посадку 43S на мРНК

17. Регуляция инициации: эукариоты мРНК-специфическая регуляцияМикро РНК (miRNA) • Механизм до конца не выяснен • Небольшие молекулы ~22 нуклеотида • Действуют в комплексе с белками (miRNP или RISC – RNA-induced silencing complex) • Комплементарно связывается с 3’UTR • Блокирует инициацию трансляции (скорее всего, белки miRNP-комплекса связываются с кэпом, вытесняя факторы eIF4F)