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基因工程 Gene Engineering

高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材. 基因工程 Gene Engineering. 彭银祥等编著. 第 5 章 基因工程载体 Vectors in Gene Engineering. 华中科技大学出版社 2008 年 2 月第二次印刷. 1 载体 （ Vectors ）. 在基因工程操作中，外源 DNA 片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体，它也是一个 DNA 分子。. 2 根据功能，把载体分为： 克隆载体和表达载体. 3. 载体的种类. 基因工程中常用的载体有 5 类：. 质粒（ plasmid ）

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  1. 高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材 基因工程Gene Engineering 彭银祥等编著 第5章 基因工程载体 Vectorsin Gene Engineering 华中科技大学出版社2008年2月第二次印刷

  2. 1 载体 （Vectors） 在基因工程操作中，外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体，它也是一个DNA分子。 2 根据功能，把载体分为： 克隆载体和表达载体

  3. 3. 载体的种类 基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）

  4. 4. 基因工程载体的必备条件 （1）复制子，在宿主细胞内能独立复制； （2）有选择性标记，有一个或多个鉴于检测的遗传标记； （3）有一段多克隆位点。位于非必需区内的DNA序列内含有多个单一的酶切位点；外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。具有较高的遗传稳定性； （5）容易从宿主细胞中分离纯化。

  5. 5.1 质粒载体 质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。一般为1-200kb。 存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。

  6. 大肠杆菌的质粒

  7. 5.1.1 质粒的一般生物学特性 （1）分子小： 1—200 kb （2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。 如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。 （3）环形状： 双链环状DNA。 （酵母的“杀伤质粒”是RNA）。

  8. （4）质粒的空间构型： ① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）

  9. ② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。 ③ 线形DNA （ linear ，lDNA）

  10. OC L SC （5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。

  11. 2. 质粒的类型 在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒: 能自我转移 非接合型质粒:不能自我转移

  12. 1. 接合型质粒： 又叫自我转移型质粒。 除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。 不符合基因工程的安全要求。

  13. 2. 非接合型质粒： 虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。 符合基因工程的安全要求。 （1）R质粒（抗性质粒）： 带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。

  14. （2）Col质粒： 带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。 大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。

  15. 质粒的复制类型 1. 严紧型质粒（stringent plasmid） 拷贝数少，只有1—3份拷贝。 （接合型质粒分子量大，一般属严紧型DNA polymerase III ）。 2. 松弛型质粒（relaxed plasmid） 拷贝数多，有10—60份拷贝。 （非接合型质粒分子量小，一般属松弛型 DNA polymerase I ）。

  16. 5.1.2 构建质粒克隆载体的基本策略 （1）去掉非必需的DNA区，保留质粒必需区，降低分子量； （2）减少质粒本身内切酶位点的数目； （3）加入易检出的筛选标记； （4）关于质粒安全性的改造，不发生重组和转移，不能离体扩增； （5）改造或增加表达基因的调控序列；如启动子、增强子等。

  17. 1. pBR322： 5.1.3 质粒克隆载体的构建 F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。 （1）元件来源 ① 复制起点 ori：pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点 ②Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因 ③ Tetr基因： pSC101的Tet r基因。

  18. （2）长度 4363bp （3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。 （4）克隆位点 24个克隆位点。 其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。

  19. 4363bp

  20. （5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。

  21. 外源基因BamH I 外源基因Pst I Amp中存活 Tet中存活 但在Tet中死亡 但在Amp中死亡 ?

  22. ③ 高拷贝数 ② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy ④ 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。

  23. （6）pBR322的缺点 保留了转移蛋白（mob）的作用位点。 能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！

  24. （7）pBR322的改进 ① 删除mob识别位点 （如质粒pBR327、pAT153等）。 pAT153： 从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。

  25. ② 改造EcoR I 位点 pBR325： 使EcoRI 也成为插入失活型位点。 在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。

  26. 2. pUC系列 University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

  27. （1）元件来源 ① 复制起点: pBR322的 ori ②Ampr 基因: pBR322的Ampr基因 ③ lacZ的启动子: 来自于大肠杆菌 ④ lacZ’基因: 大肠杆菌LacZ的-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。

  28. （2）长度：约2.7kb （3）克隆位点： 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。

  29. pUC18/19 EcoRI SacI KpnI SmalI BamHI XbaI SalI PstI SphI Hind III ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG TACTGGTACTAATGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTAGCTTCGAACCGTGAC β-galactosidase coding sequence (26aa)

  30. （4）选择标记 Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。 蓝白斑选择原理： ① Xgal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）

  31. ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 -半乳糖苷酶 半乳糖 Xgal 5-溴-4-氯靛蓝

  32. ③ lacZ的肽互补 1）-肽（ lacZ’）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 N端的11-41aa C端大部分 C端大部分 N端的11-41aa 4聚体 C端大部分 N端的11-41aa C端大部分 N端的11-41aa lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.

  33. 2）受体菌lacZ突变（lacZ∆M15） 受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a

  34. 3）载体lacZ’与互补 pUC质粒载体上的lacZ’编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。 C端大部分 N端的11-41aa 受体菌lacZ∆ pUC lacZ’

  35. 5’ lacZ’ 3’ 外源DNA 5’ lacZ’ MCS 3’ 4）互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。 肽 肽移码突变 互补 不互补

  36. ④ IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。从而互补。 但载体MCS上插入外源DNA后，不能产生肽！ IPTG

  37. IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。

  38. （5）pUC系列载体的优点 ① 更小的分子量： 如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。 ② 选择方便 Xgal显色、抗菌素双重直接选择。 ③ 克隆便利 具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。 ④ 测序方便

  39. pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。 M13mp18的多克隆位点

  40. 3.pUC的衍生质粒载体 1. pGEM-3Z 由pUC派生而来。与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。 可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。 lacZ’ Ampr T7启动子 MCS SP6启动子 ori

  41. pGEM-3Z的特点： ① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA ② 外源基因正接反接都可以转录。 ③ MCS与pUC18的完全一样。 2. pGEM-4Z： 与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。

  42. T2 Genomic DNA single linear DNA (about 182,000 bp)

  43. 5.2 噬菌体载体 1. 噬菌体的一般特性 噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。 结构： 蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。

  44. 2. 噬菌体DNA分子的特点 （1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）但在两端有cos位点，可以环化。 cos位点（cohensive-end site）： DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。

  45. DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RF DNA）。

  46. 噬菌体和其DNA

  47. 3. 噬菌体的基因组特点 • DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。 • 其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。 19.6kb 头尾蛋白合成 12-24kb 重组 整合剪切 9-11kb DNA复制 溶原

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