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禽流感抗体检验及 其他动物疫病及动物源性产品检验. 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 徐海聂 2013.11.01. 主要内容. 一 、禽流感 抗体检验 二 、其他动物疫病及动物源性产品检验. 1.1 前言.
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禽流感抗体检验及其他动物疫病及动物源性产品检验禽流感抗体检验及其他动物疫病及动物源性产品检验 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 徐海聂 2013.11.01
主要内容 一、禽流感抗体检验 二、其他动物疫病及动物源性产品检验
1.1 前言 珠海毗邻澳门，澳门市场供应的活鸡和冰鲜鸡鸭主要来自珠海。珠海局辖区有？个供港澳活禽养殖场，禽流感检验检疫是我们动检室的主要检测任务之一，同时也是活禽养殖场高度关注的一个问题。活鸡出口港澳离境前我们动检室要批批检测禽流感病毒核酸和抗体，抵达澳门后澳门民政总署化验所还要高比例抽检禽流感病毒核酸和抗体，只要珠澳两地哪个实验室的检测结果有问题，无论是病毒核酸阳性还是抗体不达标，该批活鸡便不能出口或遭遇退货、销毁。 2012年农业部更换H5疫苗毒株，新疫苗使用几个月后抗体监测结果出现异常，让我们认识了一个看似简单的禽流感抗体检测HI实验以前不曾重视的技术细节----抗原毒株对检测结果的影响。
1.2 流感病毒分类 • 根据核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）的不同流感病毒分为A型、B型和C型。三者在电镜形态、基因组组成、蛋白编码机制、表面蛋白变异频率和感染宿主范围均有不同。 • A型流感病毒可感染多种动物，包括人。所有的禽流感病毒均为A型流感病毒。 • B型和C型流感病毒主要感染人，C型流感病毒也可感染猪。
1.2 流感病毒分类 • 禽流感（Avian Influenza，AI）是正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类传染病，禽流感病毒（AIV）可感染几乎所有野生及家养禽类。 • 高致病性禽流感（HPAI）是世界动物卫生组织（OIE）规定的必须通报的疫病，也是我国农业部规定的一类动物传染病。
1.4 禽流感病毒的毒力分类 1.高致病性禽流感病毒株（HPAIV） H5N1、H7N3、H7N7 2.低致病性禽流感病毒株（LPAIV） H9N2 3.无致病性禽流感病毒株 • 禽流感病毒的寄生感染部位： 1、低致病性（LPAI）：呼吸道、肠道。 2、高致病性（HPAI）：全身。
1.5 本室禽流感抗体检测主要实验类型 • 血凝及血凝抑制试验 （HA / HI） • 琼脂免疫扩散试验 （AGID ） • 酶联免疫吸附试验 （ELISA）
1.5.1 血凝及血凝抑制试验（HA/HI） • 血凝及血凝抑制试验 （HA / HI） • 琼脂免疫扩散试验 （AGID ） • 酶联免疫吸附试验 （ELISA）
1.5.1 血凝及血凝抑制试验（HA/HI） • 血凝试验（HA） 病毒粒子上的血凝素蛋白与特定红细胞（red blood cell, RBC）表面相应受体结合，引起RBC凝集。 • 血凝抑制试验（HI）： 病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，即抗体与病毒结合后，病毒表面的血凝素无法吸附于红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝集的现象，称为血凝抑制。即抗体与血凝素结合，封闭血凝素，使之不能与红细胞结合。
1.5.1 血凝及血凝抑制试验（HA/HI） 试验特点 血凝和血凝抑制试验由于能同时进行大量样本分析,试验过程易于操作，以及结果快速、准确、灵敏、廉价等特点。
1.5.1 血凝及血凝抑制试验（HA/HI） • 应用：血凝和血凝抑制试验是各地疫病诊断、流行病学调查、免疫程序制定及免疫效果监测等的主要手段之一。 • 珠海局应用：血凝和血凝抑制试验多用于出口港澳活禽的禽病血清学监测，如：离境前禽流感H5亚型抗体的检测；注册养禽场新城疫抗体的免疫效果监测；H7、H9亚型禽流感抗体检测；鸡产蛋下降综合征抗体检测。
1.5.2 琼脂免疫扩散试验（AGID） • 血凝及血凝抑制试验 （HA / HI） • 琼脂免疫扩散试验 （AGID ） • 酶联免疫吸附试验 （ELISA）
1.5.2 琼脂免疫扩散试验（AGID） • AGID的原理是，抗原和特异性抗体在琼脂凝胶中相向扩散，当二者相遇时产生沉淀，这种沉淀稳固在凝胶中产生可见的沉淀线，沉淀线的形成也是抗原和抗体浓度最适宜之处。 • AGID是用来检测A型流感病毒型特异性血清抗体的一项试验，即抗核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）的抗体。因而，AGID适用于检测所有A型流感病毒感染后的血清抗体。另外，AGID也适应于鉴定流感病毒。 • 此法优点是简单易行，但缺点是敏感性较差，易出现假阳性。
1.5.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） • 血凝及血凝抑制试验 （HA / HI） • 琼脂免疫扩散试验 （AGID ） • 酶联免疫吸附试验 （ELISA）
1.5.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） • ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 • 由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 • 血凝试验 （HA） 试验材料和试剂 器材：96孔V型微量反应板、振荡器、25μl微量移液器； 试剂：0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）或 阿氏液； 1%鸡红细胞（RBC）悬液； 标准H5亚型禽流感病毒抗原、标准阳性血清、标准阴性血清 （由哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发有限公司提供）
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 HA操作步骤
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 结果判读 • 血凝价1:512（29） • 以红细胞发生完全凝集的病毒悬液的最高稀释倍数作为该病毒液的红细胞凝集效价。 • 将病毒做1:512倍稀释，取25ul病毒液可使25ulRBC发生凝集，即一个血凝单位。
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 • 血凝抑制试验（HI） • 4 HAU 抗原配制 根据前图的结果，配置4 HAU 的病毒抗原，即抗原效价为29（1：512），4HAU抗原稀释倍数为27（1:128）。 • 对照设置 阳性对照 阴性对照 空白对照 抗原回归
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 HI操作步骤
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 对照判读
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 结果判读
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 结果判读 抗体血凝抑制价：以完全抑制４个HAU 抗原的血清最高稀释倍数 作为 HI滴度。 • 以稀释倍数表示：1:512、1:256、1:128、1:64、1:32、 1:16 1/512、1/256、1/128、1/64、1/32、 1:64 • 以2的指数表示： 29、28、27、26、25 、24 以2的对数表示： log29、log28、log27、log26、log25、log24 9log2、8log2、7log2 、6log2 、5log2 、4log2
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 • 注意事项 工作抗原滴度 4 HAU工作抗原一定要配制准确，抗原偏高，检测结果偏低；反之，抗原偏低，检测结果偏高。 4 HAU工作抗原需现配现用，每次实验抗原回归一定要做。
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 • 注意事项 禽流感H5抗原毒株型别 • 毒株来源不同的抗原存在抗原性差异，分别用Re-5株、Re- 6株两种抗原检测同一批鸡血清，结果存在差异。 • 抗原与疫苗毒株同源，用Re-5株抗原检测Re-5免疫抗体，用Re-6株抗原检测Re-6免疫抗体，检测结果与理论值相符。 • 抗原与疫苗毒株不一致，用Re-6株抗原检测Re-5免疫抗体，用Re-5株抗原检测Re-6免疫抗体，结果异常偏低，超出OIE规定的检测要求，不能采用。 • 在日常检验检疫试验中，一定要选择与疫苗毒株同源的抗原进行检测，避免用错抗原误判检测结果。
1.6 血凝与血凝抑制试验操作 • 注意事项 PBS NaCl浓度 配制1%红细胞的 PBS中 NaCl浓度不能低。盐浓度低，红细胞易破裂，易溶血，血球保存时间短。
1.7 禽流感抗体科研简介 1.不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究 2.禽流感 H5N1 Re-5株和Re-6株抗原比对实验 3.禽流感 H7抗体 HI、ELISA 检测
1.7.1 不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究 • H5N2禽流感油乳灭活疫苗免疫后HI抗体消长规律及出口港澳活鸡HI抗体统计分析 • 不同厂家H5N2禽流感油乳灭活疫苗免疫效果比对小型试验、田间试验 • 重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型，Re-1株)免疫效果实验
1.7.1 不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究四种疫苗免疫效果比较
不同疫苗差异显著性分析 经统计学t检验两种疫苗H5平均抗体滴度，A疫苗与B疫苗、B 疫苗与C疫苗、C 疫苗与D疫苗差异不显著（P>0.05）, A疫苗与C疫苗、A疫苗与D疫苗、B疫苗与D疫苗差异极显著（P<0.01）。 36日龄组平均HI抗体滴度t检验P值 45日龄组平均HI抗体滴度t检验P值
1.7.1 不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究 不同二免时间比较 二免时间推迟，抗体维持时间较长，抗体下降时间相应推迟，64日龄以后,45日龄二免组比37日龄二免组同期抗体水平普遍高0.5～1 log2，仅D组在113日龄后又趋于一致。统计学t检验A、B、C、D四种疫苗不同二免时间的HI抗体消长曲线，P值依次为0.130、0.740、0.489、0.913，差异均不显著。
1.7.1 不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究 B、C、D三种疫苗比较 鸡只免疫接种后，D疫苗抗体上升速度最快；达到免疫保护抗体水平4 log2所需时间最短，维持较高抗体水平时间最长，至84日龄出口上市时，抗体滴度最高，≥4 log2的样品数量最多。
1.7.1 不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究 免疫二次与免疫三次比较 三次免疫比二次免疫平均抗体滴度高，尤其在56日龄峰值以后优越性更加明显。但是，据出口公司反映，部分供澳活鸡在澳门屠宰后胴体上有很明显的肿块，影响市场售价；养殖场也反映，鸡体注射疫苗部位可能出现较大水肿，并且注射35天后仍不能完全吸收。我国农业部门规定，为了保证鸡肉品质，上市前28天内不再进行灭活疫苗的注射免疫。考虑到供澳活鸡一般85日龄左右上市，60日龄实施三免将不符合这一规定，同时胴体上的肿块也难以完全吸收。既然二免已能满足检疫要求，因此不建议对供澳活鸡实施三次免疫。
1.7.1 不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究 H5N1疫苗与H5N2疫苗比较 选择同一禽流感疫苗生产厂、相同的14日龄首免45日龄二免的免疫程序，引用实验三和实验四田间实验试验数据，比较H5N1疫苗与H5N2疫苗（B疫苗）对供港澳活鸡的免疫效果。 鸡只接种疫苗后抗体达到保护水平4 log2的时间，H5N1疫苗为5周，H5N2疫苗为7周；抗体≥4 log2的有效免疫保护期，H5N1疫苗为6周，H5N2疫苗为4周；最高平均抗体峰值，H5N1疫苗为8 log2，H5N2疫苗为6.3 log2；84日龄鸡只上市时的平均抗体滴度，H5N1疫苗为6.44 log2，H5N2疫苗为4.20 log2。数据显示，对于供港澳活鸡的免疫效果，H5N1疫苗好于H5N2疫苗。
1.7.1 不同厂家禽流感H5N2疫苗免疫效果比较研究 结果： • 不同厂家的H5N2疫苗免疫效果存在差异，以D疫苗免疫效果最好,然后依次为C疫苗、B疫苗、A疫苗。 • 推荐禽流感灭活疫苗对供港澳肉鸡的免疫程序为：首免14日龄，0.3ml/只，颈部皮下注射；二免45日龄，0.5ml/只，胸肌注射。 • 对于供港澳肉鸡的禽流感免疫效果，H5N1疫苗好于H5N2疫苗。 • 同一厂家不同批号的禽流感疫苗免疫效果存在一定的差异。 • 毒株来源不同的抗原可能会存在抗原性差异，因而使检测同一血清的结果有差别，如禽流感H5 HI抗原有H5N1 Re-1株、Re-4株、Re-5株，分别用不同抗原检测同一批鸡血清，结果有约1 log2的差异，疫苗与抗原同源检测结果高。
1.7.2 禽流感H5N1 Re-5株和Re-6株抗原比对实验 • 首免二免均用Re-5株疫苗 检测8批108份鸡血清 • 8批Re-5株抗原检测结果平均值全部高于Re-6株检测结果，两种抗原检测结果相差2.1 log2～5.6 log2，平均4.1 log2。 • 单份血清两抗原检测结果极差可达10 log2，样品Re-5株抗原检测结果抗体非常高而Re-6株抗原完全检不出抗体。 • 33份样品Re-6株抗原检测结果阴性（滴度＜4 log2）而Re-5株抗原检测结果阳性（滴度≥4 log2）。 • 检测结果还显示，Re-5株抗原检测结果标准差比Re-6株抗原检测结果标准差小，批内各样品Re-5株抗原检测结果抗体滴度水平比较集中整齐，Re-6株抗原检测结果抗体滴度水平分散，高低不齐，4批Re-6株抗原检测结果抗体不达标（每批14份样品要求10份以上滴度≥4 log2）的样品Re-5株抗原检测符合出口要求。
1.7.2 禽流感H5N1 Re-5株和Re-6株抗原比对实验 • 首免二免均用Re-6株疫苗检测35批490份鸡血清 • 35批Re-6株抗原检测结果平均值全部高于Re-5株检测结果，两种抗原检测结果相差1.7 log2～5.7 log2，平均4.2 log2。 • 单份血清两抗原检测结果极差可达9 log2，样品Re-6株抗原检测结果抗体非常高而Re-5株抗原完全检不出抗体。 • 182份样品Re-5株抗原检测阴性而Re-6株抗原检测阳性。 • 21批Re-5株抗原检测结果抗体不达标的样品Re-6株抗原检测符合出口要求。
1.7.2 禽流感H5N1 Re-5株和Re-6株抗原比对实验 • 首免Re-5株疫苗二免Re-6株疫苗 检测25批346份鸡血清 • 两种抗原检测结果平均值互有高低，14批Re-5株抗原检测结果高于Re-6株检测结果，两种抗原检测结果相差0.1 log2～5.6 log2，平均1.5 log2；1批两种抗原检测结果平均值相等；10批Re-6株抗原检测结果高于Re-5株检测结果，两种抗原检测结果相差0.1 log2～5.2 log2，平均1.7 log2。 • 单份血清两抗原检测结果极差可达9 log2。部分样品Re-6株抗原检测结果高Re-5株抗原检测结果低，相反，部分样品Re-5株抗原检测结果高Re-6株抗原检测结果低，也有部分样品两种抗原检测结果相近。 • 2批Re-5株抗原检测结果抗体不达标的样品Re-6株抗原检测结果符合出口要求，2批Re-6株抗原检测结果抗体不达标的样品Re-5株抗原检测符合出口要求。
1.7.2 禽流感H5N1 Re-5株和Re-6株抗原比对实验 • 免疫背景不详 检测14批209份鸡血清 • 两种抗原检测结果平均值互有高低，7批Re-5株抗原检测结果高于Re-6株检测结果，两种抗原检测结果相差0.5 log2～4.1 log2，平均1.7 log2； 7批Re-6株抗原检测结果高于Re-5株检测结果，两种抗原检测结果相差0.3log2～5.6log2，平均3.7 log2。 • 4批Re-5株抗原检测结果抗体不达标的样品Re-6株抗原检测符合出口要求。 • 2批Re-6株抗原检测结果抗体不达标的样品Re-5株抗原检测符合出口要求。 • 1批60份外单位委托检验的非出口鸡血清，Re-5株抗原检测结果最高5 log2，最低0 log2，平均3.7 log2，阴性样品20份，达不到农业部规定的70%阳性的免疫要求；而用Re-6株抗原检测，结果均在6 log2以上，平均7.5 log2，抗体滴度高而整齐，符合农业部的免疫要求。
1.7.2 禽流感H5N1 Re-5株和Re-6株抗原比对实验 结论： • 毒株来源不同的抗原存在抗原性差异，分别用Re-5株、Re-6株两种抗原检测同一批鸡血清，结果存在差异。 • 抗原与疫苗毒株同源，用Re-5株抗原检测Re-5免疫抗体，用Re-6株抗原检测Re-6免疫抗体，检测结果与理论值相符。 • 抗原与疫苗毒株不一致，用Re-6株抗原检测Re-5免疫抗体，滴度平均低4.1 log2；用Re-5株抗原检测Re-6免疫抗体，滴度平均低4.2 log2，结果偏差大，超出OIE规定的检测要求，不能采用。 • 首免Re-5株二免Re-6株疫苗的鸡血清和免疫背景不详的鸡血清，由于二次免疫使用的疫苗和二次免疫时间的不同，Re-5免疫抗体和Re-6免疫抗体对检测结果的贡献不同，两种抗原的检测结果可能有差异，在一种抗原检测结果阴性时建议用另一种抗原再行检测。 • 在日常检验检疫试验中，一定要选择与疫苗毒株同源的抗原进行检测，避免用错抗原误判检测结果。
主要内容 一、禽流感抗体检验 二、其他动物疫病及动物源性产品检验
2.1 主要检验业务 主要检测范围 • 禽病 • 猪病 • 马病 • 牛病 • 犬病 • 鱼病 • 虾病 • 动物源性成分鉴别 • 动物源性滋补品鉴别
2.2 主要实验方法 • 血凝和血凝抑制试验 (HA / HI) • 琼脂免疫扩散试验 (AGID) • 酶联免疫吸附试验 (ELISA) • 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR ） • 荧光RT-PCR
2.3掺假肉类DNA鉴定（13种） • 牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉、鸡肉等肉类掺假检测鉴定。
2.4名贵滋补品掺假鉴别（4种） • 燕窝 • 鱼翅 • 鹿茸 • 花胶
2.4名贵滋补品掺假鉴别（4种） 检验方法 提取脊椎动物成分DNA ↓ PCR 技术扩增DNA ↓ 测序 ↓ 序列比较
